本文選題：缺血再灌注　切入點：電針　出處：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2014年碩士論文

【摘要】：背景 缺血性腦卒中嚴(yán)重威脅人類健康，是全球第2大死因，平均每4min就有一人死于中風(fēng)。其存活者致殘率高達(dá)90％，造成了巨大的社會和家庭負(fù)擔(dān)。由于病因復(fù)雜多變，目前仍缺乏切實有效的干預(yù)和治療措施。 氧化應(yīng)激是參與缺血性腦卒中的病理生理變化的重要機制之一。腦缺血再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)后，大量的自由基及氧衍生自由基的產(chǎn)生伴隨著抗氧化劑的大量消耗。氧化應(yīng)激能夠損傷細(xì)胞DNA、蛋白質(zhì)和細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞損傷與死亡。因此，激活抗氧化系統(tǒng)對抗氧化應(yīng)激損傷是減輕缺血再灌注損傷的重要途徑。我們研究發(fā)現(xiàn)電針預(yù)處理（Electroacupuncture Pretreatment）能夠誘導(dǎo)腦缺血耐受，減輕腦缺血再灌注損害。新近研究證實電針預(yù)處理能夠激活神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)，上調(diào)硫氧還蛋白（Thioredoxin，Trx）和谷胱甘肽（Glutathione，GSH）等物質(zhì)的表達(dá)，減少丙二醛等氧化產(chǎn)物的生成，表明電針預(yù)處理的腦保護(hù)作用機制與激活抗氧化系統(tǒng)，減輕氧化應(yīng)激損傷密切相關(guān)。我們的研究結(jié)果證實，電針預(yù)處理可能通過內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)產(chǎn)生腦保護(hù)作用，但其調(diào)節(jié)的下游分子機制有待闡明。研究已證實內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病被廣泛研究，已被證明是調(diào)制眾多病理過程，氧化應(yīng)激就是其中之一。有研究提示內(nèi)源性大麻素配體2-花生四烯酸甘油（2-arachidonylglycerol,2-AG）可以修改H2O2和ROS刺激引起的胞內(nèi)Ca2+動員和細(xì)胞骨架重排，并可以減少Ca2+誘導(dǎo)的線粒體細(xì)胞色素C釋放，刺激呼吸鏈功能，表明內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)可以改善H2O2和ROS造成的氧化應(yīng)激損傷。2-AG主要作用于內(nèi)源性大麻素CB1受體，激活下游通路發(fā)揮作用。 Peroxiredoxin6(Prdx6)屬于抗氧化蛋白超家族Peroxiredoxins（Prdxs），主要分布于細(xì)胞質(zhì)中，是一種新型的抗氧化劑。Prdx6是Prdxs家族唯一使用谷胱甘肽和抗壞血酸作為電子供體的成員，具有除去H2O2和磷脂過氧化氫的能力，并且能夠減少磷脂氫過氧化物在質(zhì)膜的積累。研究表明Prdx6在心臟和肝臟組織的缺血再灌注損傷中具有不可替代的作用，然而Prdx6在腦缺血再灌注損傷中的具體作用尚待闡明。 因此本研究為了觀察Prdx6的表達(dá)在腦缺血再灌注損傷過程中的具體機制，采用大腦中動脈閉塞模型（Middle Cerebral Artery Occlusion, MCAO）進(jìn)行實驗，并探討Prdx6在電針預(yù)處理發(fā)揮腦缺血耐受效應(yīng)中的機制。 實驗一電針預(yù)處理對腦缺血再灌注后Prdx6表達(dá)的影響 目的：探討腦缺血再灌注后Prdx6在缺血半暗帶的表達(dá)變化，進(jìn)一步研究經(jīng)電針預(yù)處理腦缺血再灌注后Prdx6的表達(dá)變化。 方法： SPF級雄性SD大鼠，體重280-320g，采用隨機數(shù)字法分組。 ①腦缺血再灌注后Prdx6在缺血半暗帶的表達(dá)變化 雄性大鼠22只，分為假手術(shù)（sham）組（n=2）和腦缺血再灌注組（n=20）。其中腦缺血再灌注組的20只大鼠再次隨機分為五組，即建立MCAO動物模型后，阻斷血流時間為2h，于再灌注后的2h，6h，12h，24h和48h分別取腦（n=4），用Western blot方法檢測梗死同側(cè)半暗帶腦組織中Prdx6表達(dá)量的變化。 ②電針預(yù)處理對腦缺血再灌注后Prdx6的表達(dá)影響 雄性大鼠20只，隨機分為假手術(shù)（sham）組（n=2）、局灶性腦缺血再灌注（MCAO）組、單純電針（EA）組和電針預(yù)處理（EA+MCAO）組(n=6)。單純電針組只進(jìn)行電針刺激不制作模型。電針預(yù)處理組建立模型前2h給予電針刺激百會穴，30min，頻率15/2Hz、強度1-2mA。每組3只進(jìn)行western blotting檢測，另3只行免疫熒光染色。 結(jié)果：①Western blot結(jié)果顯示腦組織缺血再灌注后24h Prdx6蛋白在腦組織缺血半暗帶表達(dá)水平明顯升高(P0.05)；②Western blot結(jié)果顯示再灌后Prdx6蛋白在EA+MCAO組相對于MCAO組明顯升高(P0.05)，免疫熒光雙標(biāo)染色結(jié)果顯示Prdx6蛋白在缺血半暗帶的星形膠質(zhì)細(xì)胞有表達(dá)，且再灌注后24h Prdx6蛋白顯著升高。 結(jié)論：Prdx6蛋白在腦組織缺血再灌注后24h半暗帶表達(dá)水平顯著升高，并且給予電針預(yù)處理后Prdx6的表達(dá)進(jìn)一步升高。 實驗二Prdx6參與電針預(yù)處理腦保護(hù)作用的研究 目的：探討電針預(yù)處理產(chǎn)生的神經(jīng)保護(hù)作用能否通過下調(diào)Prdx6表達(dá)而逆轉(zhuǎn)。 方法： ①側(cè)腦室注射Prdx6-siRNA并進(jìn)行效能驗證 雄性SD大鼠8只，隨機分為正常對照組（sham）組（n=2），小RNA干擾（siRNA）組和亂序RNA（scrambled control RNA，scr RNA）組（n=3），其中siRNA組的大鼠均進(jìn)行側(cè)腦室注射Prdx6-siRNA，而scr RNA組則注射公司提供的scr RNA，注射72h后應(yīng)用Western blotting方法檢測梗死同側(cè)相應(yīng)半暗帶腦組織中Prdx6的表達(dá)變化。 ②下調(diào)Prdx6表達(dá)后大鼠神經(jīng)功能和形態(tài)變化 雄性SD大鼠38只，隨機分為假手術(shù)（sham）組（n=4）、局灶性腦缺血再灌注（MCAO）組、電針預(yù)處理（EA+MCAO）組、Prdx6的siRNA干擾（siRNA）組和對照亂序RNA（scr RNA）組(n=8)。siRNA組和scr RNA組在制作模型前3天行側(cè)腦室注射，MCAO模型前2h電針預(yù)處理30min。每組大鼠缺血恢復(fù)灌注后24h按照盲法原則進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評分。每組4只動物進(jìn)行TTC染色，另4只快速取腦石蠟包埋行TUNEL染色。 結(jié)果：①Western blotting效能驗證:采用側(cè)腦室注射，Prdx6-siRNA能夠顯著降低Prdx6的表達(dá)50%以上（P0.05）。②神經(jīng)行為學(xué)評分:與Sham組相比，其他各組評分均下降。電針預(yù)處理后MCAO模型再灌24h（EA+MCAO組）的神經(jīng)行為學(xué)評分明顯高于MCAO組。而側(cè)腦室注射Prdx6-siRNA后，相較于EA+MCAO組，神經(jīng)行為學(xué)評分明顯降低，逆轉(zhuǎn)了電針預(yù)處理產(chǎn)生的缺血耐受作用（P0.05），siRNA組與MCAO組則沒有明顯統(tǒng)計學(xué)差異。③TTC染色和梗死容積：與MCAO組比較，EA+MCAO組大鼠再灌注24h的腦梗死容積百分比明顯縮�。≒0.01vs.MCAO組）。Prdx6-siRNA組的腦梗死容積百分比則顯著高于Sham組和EA+MCAO組（P0.05vs. EA+MCAO組），同時scr RNA組與EA+MCAO組則沒有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異，但是與MCAO組相比都有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）。④TUNEL染色：細(xì)胞計數(shù)結(jié)果顯示，EA+MCAO組中的TUNEL陽性細(xì)胞(53.75±12.34)數(shù)量較MCAO組(76.75±14.64, P0.01)明顯減少，而siRNA組中的TUNEL陽性細(xì)胞(86.25±5.68)數(shù)量較EA+MCAO組(P0.01)增高。siRNA組相對于MCAO組，scr RNA組相對于EA+MCAO組都沒有明顯統(tǒng)計學(xué)差異。 結(jié)論：下調(diào)Prdx6表達(dá)可以顯著逆轉(zhuǎn)電針預(yù)處理產(chǎn)生的腦保護(hù)作用。 實驗三Prdx6參與電針預(yù)處理抗氧化作用的研究 目的：探討電針預(yù)處理是否通過調(diào)控Prdx6能夠發(fā)揮抗氧化作用。 方法：雄性SD大鼠60只，，隨機分為假手術(shù)（sham）組、短暫局灶腦缺血再灌注（MCAO）組、電針預(yù)處理（EA+MCAO）組、Prdx6的siRNA干擾（siRNA）組和對照亂序RNA（scr RNA）組(n=12)。其中每組大鼠6只在MCAO模型恢復(fù)灌注后24h深麻醉取材提取組織蛋白用ROS，MDA和Nitrotyrosine ELISA試劑盒檢測，其余大鼠取材后提取組織DNA用8-OH-dG試劑盒檢測，按照試劑盒說明逐一操作。 結(jié)果：Prdx6-siRNA增加了ROS的產(chǎn)生,升高了MDA,8-OH-dG和NT的水平,從而逆轉(zhuǎn)了電針預(yù)處理的保護(hù)作用。(P 0.05vs. EA+MCAO組，n=6)。 結(jié)論：電針預(yù)處理通過上調(diào)Prdx6從而發(fā)揮抗氧化作用。 實驗四電針預(yù)處理通過大麻素CB1R調(diào)節(jié)Prdx6的研究 目的：探討Prdx6是否通過激活CB1受體依賴途徑發(fā)揮電針預(yù)處理的神經(jīng)保護(hù)作用。 方法：SPF級雄性SD大鼠15只，隨機分為5組，CB1受體拮抗劑AM251組、SR141716組和CB1激動劑W55212-2組，ACEA組，和溶劑組（n=3）。Sham組、MCAO組、EA組和EA+MCAO組仍采用前面實驗的蛋白樣品。用CB1受體拮抗劑AM251和SR141716與激動劑W55212-2和ACEA，按照劑量AM251（1mg/kg）、SR141716（1mg/kg）、ACEA（2.5mg/kg）、WIN-55212-2（1.5mg/kg）和溶劑（DMSO,0.6ml/kg）在MCAO模型前半小時腹腔注射給藥。再灌注后24h即刻深麻醉大鼠取腦組織缺血半暗帶行Western Blotting檢測。 結(jié)果：Western blotting檢測結(jié)果顯示，與MCAO組相比， EA+MCAO組Prdx6蛋白表達(dá)水平增高。而與EA+MCAO組相比, AM251組或SR141716組Prdx6表達(dá)水平相對較低,溶劑組和EA+MCAO組之間沒有區(qū)別（P0.05vs. EA+MCAO組）。與MCAO組相比WIN55212-2和ACEA升高了Prdx6的蛋白表達(dá)，而溶劑組與MCAO組之間沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P0.05vs. MCAO）。 結(jié)論：電針預(yù)處理能夠通過CB1R依賴途徑調(diào)節(jié)Prdx6發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。 小結(jié) 以上結(jié)果表明：Prdx6蛋白在腦組織缺血再灌注后24h半暗帶表達(dá)水平顯著升高，給予電針預(yù)處理可以進(jìn)一步升高Prdx6的表達(dá)；電針預(yù)處理可以減少腦缺血再灌注后梗死容積，改善神經(jīng)行為學(xué)功能評分并發(fā)揮抗氧化作用，然而下調(diào)Prdx6表達(dá)可以顯著逆轉(zhuǎn)電針預(yù)處理產(chǎn)生的一系列保護(hù)效應(yīng)，表明Prdx6參與了電針預(yù)處理所產(chǎn)生的腦保護(hù)作用；進(jìn)一步研究證實，給予CB1受體拮抗劑可以部分下調(diào)EA后Prdx6的表達(dá)，而給予CB1受體激動劑則可以模擬電針預(yù)處理的作用，說明電針預(yù)處理通過內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)CB1受體調(diào)節(jié)Prdx6產(chǎn)生腦保護(hù)作用。綜上所述，電針預(yù)處理通過上調(diào)Prdx6從而發(fā)揮腦保護(hù)效應(yīng)，這為EA預(yù)處理的抗氧化作用提供了新的機制。
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【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R614

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 熊利澤,路志紅,侯立朝,鄭恒興,朱正華,王強,陳紹洋;Pretreatment with repeated electroacupuncture attenuates transient focal cerebral ischemic injury in rats[J];Chinese Medical Journal;2003年01期

2 ;Involvement of δ-and μ-opioid receptors in the delayed cerebral ischemic tolerance induced by repeated electroacupuncture preconditioning in rats[J];Chinese Medical Journal;2007年05期

3 江克文,張瑛,水泉祥;電針預(yù)處理對新生大鼠缺氧缺血性腦損傷保護(hù)作用的可能機制[J];中國中西醫(yī)結(jié)合雜志;2003年12期

本文編號：1686049