本文選題：嗎啡耐受　切入點(diǎn)：SIRT1　出處：《中南大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：研究背景：?jiǎn)岱仍谂R床上是一種有效且應(yīng)用廣泛的止痛劑,但是患者長(zhǎng)時(shí)間使用嗎啡鎮(zhèn)痛會(huì)產(chǎn)生一種對(duì)嗎啡耐受的藥理現(xiàn)象,即等量的藥物緩解疼痛的時(shí)間越來(lái)越短、鎮(zhèn)痛效果也越來(lái)越差,必須不斷加大劑量才能緩解疼痛,但是加大嗎啡用量的同時(shí)又帶來(lái)了惡心、嘔吐、便秘等副作用。盡管已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)嗎啡耐受的眾多因素,但是嗎啡耐受的機(jī)制仍是醫(yī)學(xué)疼痛領(lǐng)域的一大挑戰(zhàn)性課題。有大量的研究發(fā)現(xiàn)嗎啡耐受和神經(jīng)病理性疼痛有許多共同的發(fā)生機(jī)制,近來(lái)人們?cè)谏窠?jīng)病理性疼痛領(lǐng)域關(guān)于表觀遺傳學(xué)機(jī)制的研究給我們探索嗎啡耐受的發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供了非常重要的信息。 表觀遺傳調(diào)控主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾(磷酸化、甲基化和乙酰化)和小RNA調(diào)節(jié)。而其中的組蛋白乙酰化修飾是指由組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(histone acetylase,HAT)和組蛋白去乙�；�(histone deacetylase,HDAC)對(duì)核心組蛋白N端特定的賴氨酸(lysine,Lys)殘基進(jìn)行乙酰化和去乙�；�,調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄。關(guān)于嗎啡耐受的表觀遺傳學(xué)機(jī)制的相關(guān)研究較少,本課題的完成將為嗎啡耐受的機(jī)制研究提供新的信息和線索,為克服嗎啡耐受這個(gè)醫(yī)學(xué)難題提供新的思路和方向。 研究目的：觀察嗎啡耐受大鼠嗎啡的鎮(zhèn)痛效應(yīng)變化,同時(shí)檢測(cè)脊髓腰膨大中總體乙酰化組蛋白H3(Acetyl-Histone H3,Ac-H3)和第Ⅲ類經(jīng)典去組蛋白乙�；窼IRT1(Sirtuin type1)表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化,探索組蛋白去乙酰化酶SIRT1在慢性嗎啡耐受的發(fā)生發(fā)展中的潛在作用；采用SIRT1的激動(dòng)劑白藜蘆醇鞘內(nèi)注射,上調(diào)SIRT1的表達(dá),觀察其對(duì)慢性嗎啡耐受大鼠疼痛行為學(xué)的影響,并檢測(cè)各組脊髓腰膨大總體Ac-H3、Ac-H3、SIRT1、NR2B的表達(dá)變化,探索慢性嗎啡耐受的組蛋白乙酰化的調(diào)控機(jī)制,為慢性嗎啡耐受的治療提供理論探索。 研究方法：1.將成年雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠(體重280-320g)隨機(jī)分為生理鹽水組(normal saline, NS組)、嗎啡耐受I組(morphine tolerance,MT I組)和嗎啡耐受Ⅱ組(MT Ⅱ組)。測(cè)量全部大鼠機(jī)械痛閾和熱痛閾基礎(chǔ)值后,按改良Yaksh法對(duì)大鼠進(jìn)行鞘內(nèi)置管,在實(shí)驗(yàn)期間(13天)嗎啡耐受Ⅰ組連續(xù)6天每天兩次鞘內(nèi)注射嗎啡(10μg)形成嗎啡耐受后從第7天開(kāi)始改為每天鞘內(nèi)注射一次嗎啡(10μg)一次等容積的生理鹽水注射；嗎啡耐受Ⅱ組持續(xù)每日(13天)鞘內(nèi)注射兩次嗎啡(10μg)；生理鹽水組則注射相同容積的生理鹽水代替嗎啡Ⅱ組的嗎啡注射。分別于術(shù)后的第1、3、5、7、9、11、13天測(cè)定大鼠的機(jī)械痛閾和熱痛閾,根據(jù)機(jī)械痛閾和熱痛閡的變化,選擇適合研究嗎啡耐受逆轉(zhuǎn)的嗎啡耐受模型進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)研究。 2.將成功鞘內(nèi)置管的SD成年雄性大鼠隨機(jī)分為2組即生理鹽水組(normal saline, NS組)、嗎啡耐受組(morphine tolerance,MT組)。測(cè)量?jī)山M大鼠機(jī)械痛閾和熱痛閾基礎(chǔ)值后,嗎啡耐受組按第一步選擇出來(lái)的嗎啡耐受模型進(jìn)行嗎啡注射；生理鹽水組則注射相同容積的生理鹽水代替嗎啡耐受組的嗎啡注射。分別于術(shù)后的第1、3、5、7、9、11、13天測(cè)定大鼠的機(jī)械痛閾和熱痛閾,并在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)取大鼠脊髓腰膨大組織實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶反應(yīng)(quantificational reverse transcription polymerase chain reaction, qRT-PCR)技術(shù)檢測(cè)第Ⅲ類去乙酰化酶SIRT1mRNA,采用免疫印跡(western blot, WB)技術(shù)檢測(cè)SIRT1、Ac-H3、Ac-H4(Acetyl-HistoneH4)的表達(dá)變化。 3.將已經(jīng)成功置管的SD成年雄性大鼠隨機(jī)分為7組,分別為生理鹽水組(NS組)、嗎啡耐受組(MT組)、白藜蘆醇組(Resveratrol, RES15μg組、ZES30μg組、RES60μg組和RES300μg組)和溶媒組(dimethyl sulfoxide, DMSO組)。測(cè)量各組大鼠的基礎(chǔ)痛閾后,生理鹽水組持續(xù)每天兩次鞘內(nèi)注射生理鹽水10山,而其他6組持續(xù)每天兩次鞘內(nèi)注射嗎啡10μg形成嗎啡耐受后,從第7天起在兩次嗎啡注射之間鞘內(nèi)注射白藜蘆醇(15μg、30μg、60μg、300μ)和DMSO。分別在術(shù)后的第1、3、5、7、9、11、13天測(cè)量各組大鼠熱痛閾、機(jī)械痛閾,觀察在嗎啡耐受后持續(xù)鞘內(nèi)注射不同劑量的白藜蘆醇對(duì)嗎啡的鎮(zhèn)痛效應(yīng)的影響,選取可以逆轉(zhuǎn)嗎啡耐受最小有效劑量進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。 4.將成功置管的SD成年雄性大鼠(體重280-320g)隨機(jī)分為4組,分別為生理鹽水組(NS組)、嗎啡耐受組(MT組)、溶媒組(DMSO組)、白藜蘆醇組(Res組)。測(cè)量各組大鼠的基礎(chǔ)痛閾后。NS組整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間(13天)每日兩次鞘內(nèi)注射生理鹽水10山,而MT、DMSO和RES組持續(xù)每天兩次鞘內(nèi)注射嗎啡10μg,待大鼠都形成了慢性嗎啡耐受后,繼續(xù)予以原劑量嗎啡維持嗎啡耐受狀態(tài)并從第7天開(kāi)始分別鞘內(nèi)注射生理鹽水、DMSO和最小有效劑量白藜蘆醇至第13天。期間測(cè)量各組大鼠術(shù)后的第1、3、5、7、9、11、13天熱痛閾、機(jī)械痛閾。第13天完成行為學(xué)測(cè)試后將大鼠深麻醉狀態(tài)下處死,取其脊髓腰膨大采用免疫組織化學(xué)檢測(cè)各組大鼠脊髓背角SIRT1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的變化；采用qRT-PCR檢測(cè)各組大鼠脊髓腰膨大組織SIRT1mRAN、NR2BmRAN表達(dá)變化；免疫印跡(western blot,WB)方法檢測(cè)各組大鼠脊髓腰膨大總體Ac-H3、SIRT1和NR2B蛋白水平表達(dá)變化。 研究結(jié)果：1.生理鹽水組(NS組)、嗎啡耐受組(MT Ⅰ組)和嗎啡耐受組(MT Ⅱ組)大鼠的基礎(chǔ)痛閾無(wú)明顯差異(P0.05)在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間,NS組的機(jī)械痛閾和熱痛閾和基礎(chǔ)痛閾相比均無(wú)明顯差異(P0.05)。MT Ⅰ組和MT Ⅱ組在嗎啡鞘內(nèi)注射后的第1、3天,大鼠的機(jī)械痛閾和熱痛閾與基礎(chǔ)痛閾對(duì)比明顯升高(P0.05),嗎啡的鎮(zhèn)痛效應(yīng)較強(qiáng)。到第7天,嗎啡的鎮(zhèn)痛效應(yīng)完全消失,機(jī)械痛閾和熱痛閾與基礎(chǔ)痛閾相比無(wú)明顯差異(P0.05)；之后MTⅡ組大鼠的嗎啡耐受狀態(tài)持續(xù)至第13天,而MT1組大鼠的嗎啡耐受狀態(tài)慢慢減輕,至第13天,嗎啡的鎮(zhèn)痛效應(yīng)明顯恢復(fù)。 2.生理鹽水組(NS組)、嗎啡耐受組(MT組)大鼠的基礎(chǔ)痛閾無(wú)明顯差異(P0.05)。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間,NS組的機(jī)械痛閾和熱痛閾和基礎(chǔ)痛閾相比均無(wú)明顯差異.(P0.05)。嗎啡耐受組大鼠在第7天已經(jīng)產(chǎn)生了徹底的嗎啡耐受,并持續(xù)至第13天。在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)取兩組大鼠脊髓腰膨大組織進(jìn)行qRT-PCR分析,發(fā)現(xiàn)與生理鹽水組相比,嗎啡耐受組大鼠脊髓腰膨大組織SIRT1mRNA表達(dá)從第5天開(kāi)始明顯下降,并持續(xù)至第13天；WB分析結(jié)果顯示與生理鹽水組大鼠相比,也是在第5天,嗎啡耐受組大鼠脊髓腰膨大組織總體Ac-H3蛋白水平出現(xiàn)明顯升高、SIRT1蛋白表達(dá)明顯下降,持續(xù)到第13天,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中總體Ac-H4蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異(P0.05)。 3. NS組、MT組、Res15μg組、Res30μg組、Res60μg組、Res300μg組和DMSO組大鼠術(shù)前基礎(chǔ)機(jī)械痛閾和熱痛閾值無(wú)明顯差異(P0.05)。在第7-13天,NS組、MT組和DMSO組機(jī)械痛閾和熱痛閾與基礎(chǔ)痛閾值相比無(wú)明顯差異(P0.05)；第9天時(shí)Res30μg組、Res60μg組和Res300μg組的嗎啡鎮(zhèn)痛效應(yīng)開(kāi)始明顯恢復(fù),持續(xù)到第13天,熱痛閾、機(jī)械痛閾與基礎(chǔ)痛閾相比有顯著性差異(P0.05),而Res15μg組嗎啡的鎮(zhèn)痛效應(yīng)并不能恢復(fù),大鼠熱痛閾、機(jī)械痛閾與基礎(chǔ)痛閾比較無(wú)明顯差異(P0.05)。與Res30μg組相比,Res60μg組和Res300μg組的嗎啡鎮(zhèn)痛效應(yīng)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 4.與DMSO組大鼠比較,第7-13天嗎啡耐受大鼠鞘內(nèi)注射白藜蘆醇后機(jī)械痛閾和熱痛閾明顯升高,嗎啡耐受明顯逆轉(zhuǎn)(P0.05)；NS組、MT組、Res組和DMSO組第13天大鼠脊髓腰膨大處的免疫組化顯示,SIRT1主要在脊髓背角淺層Ⅰ-Ⅲ層致密表達(dá),陽(yáng)性顆粒主要表達(dá)在細(xì)胞核,胞漿可見(jiàn)少量表達(dá)。嗎啡耐受大鼠的脊髓背角淺層SIRT1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較NS組明顯減少,但是經(jīng)過(guò)白藜蘆醇干預(yù)后的嗎啡耐受大鼠的脊髓背角處的SIRT1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較MT組明顯增多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。qRT-PCR的結(jié)果顯示,較MT組比較,Res組大鼠脊髓腰膨大中的NR2BmRNA表達(dá)明顯下降,而SIRT1mRNA表達(dá)明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；WB結(jié)果顯示, Res組大鼠脊髓腰膨大處的SIRT1蛋白水平的變化和qRT-PCR的結(jié)果一致；MT組NR2B和Ac-H3的蛋白水平變化和NS組相比較明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；和MT組大鼠相比,白藜蘆醇干預(yù)后的Res組大鼠脊髓NR2B和Ac-H3的蛋白水平則出現(xiàn)明顯下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 研究結(jié)論：1.連續(xù)6天每天兩次鞘內(nèi)注射嗎啡10μg形成的嗎啡耐受狀態(tài)需要繼續(xù)原劑量的嗎啡注射才能維持,嗎啡持續(xù)耐受狀態(tài)下研究嗎啡耐受逆轉(zhuǎn)機(jī)制更有意義。 2.脊髓腰膨大處總體Ac-H3和SIRT1在術(shù)后第7天即嗎啡耐受形成的時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)了明顯的下調(diào),而在之后的嗎啡耐受狀態(tài)下一直處于低表達(dá)狀態(tài)。和嗎啡耐受大鼠行為學(xué)變化相同步。提示大鼠脊髓腰膨大處總體H3的乙酰化水平和去乙�；窼IRT1異常表達(dá)很可能在嗎啡耐受的形成機(jī)制中起著重要的作用。 3.30μg白藜蘆醇持續(xù)鞘內(nèi)注射可以明顯逆轉(zhuǎn)嗎啡耐受但是白藜蘆醇(≥30μg)的逆轉(zhuǎn)嗎啡效應(yīng)無(wú)劑量依賴性。 4.白藜蘆醇上調(diào)SIRT1表達(dá)的同時(shí)也影響了脊髓總體Ac-H3和NR2B受體的表達(dá)。提示白藜蘆醇的逆轉(zhuǎn)嗎啡耐受效應(yīng)很可能是通過(guò)依賴SIRT1組蛋白去乙�；傅墓δ軄�(lái)調(diào)節(jié)NR2B基因表達(dá)的。
[Abstract]:Background : morphine is an effective and widely used analgesic in clinic , but the long - term use of morphine in patients produces a pharmacological phenomenon of tolerance to morphine .

The epigenetics regulation mainly includes DNA methylation , histone modification ( phosphorylation , methylation and acetylation ) and small RNA regulation . The histone acetylation modification refers to the acetylation and de - acetylation of lysine ( lysine ) residues specific to the N - terminal of the core histone by histone acetyl transferase ( HDAC ) . The completion of the subject will provide new information and clues for the study of the mechanism of morphine tolerance , and provide new ideas and directions for overcoming the medical problem of morphine tolerance .

Objective : To observe the changes of analgesic effect of morphine in morphine tolerance rats , and to detect the dynamic changes of the expression of histone H3 ( Ac - H3 ) and class鈪，

本文編號(hào)：1682357