本文選題：β-內(nèi)啡肽　切入點(diǎn)：腺病毒　出處：《蘇州大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：研究背景和目的 慢性疼痛是目前最常見也是最缺乏有效治療手段的疾病。對于那些晚期癌痛患者，疼痛往往成為他們生命最后階段最為痛苦的經(jīng)歷。有研究顯示約有三分之二的晚期癌痛患者會發(fā)生骨轉(zhuǎn)移，骨轉(zhuǎn)移也被認(rèn)為是癌癥引起疼痛最為常見的原因，，腫瘤細(xì)胞的不斷浸潤，正常的骨質(zhì)結(jié)構(gòu)遭到破壞，其結(jié)果是受侵犯骨在輕度受力的情況下即會出現(xiàn)劇烈的疼痛反應(yīng)，這是影響晚期腫瘤患者生存質(zhì)量的主要原因之一。有效的止痛治療已成為目前亟待解決的問題。靜脈或口服阿片類藥物是緩解疼痛的有效方法，但又帶來諸多副作用，如過度鎮(zhèn)靜、呼吸抑制、便秘以及成癮等。病人自控鎮(zhèn)痛技術(shù)的出現(xiàn)，給癌痛患者帶來了福音，但同樣存在難以長期維持、增加感染機(jī)會、費(fèi)用較高等問題。尋找更方便、有效、作用持久且經(jīng)濟(jì)、安全的鎮(zhèn)痛方法，成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。近年來，用基因治療的方法來處理慢性疼痛，利用外源性載體介導(dǎo)內(nèi)源性蛋白直接或間接作用于外周和中樞神經(jīng)元，有著比化學(xué)藥物或蛋白制劑純度高、副作用少、耐受發(fā)生率低，且可利用載體表達(dá)的特異性和長期性等優(yōu)勢，解決了臨床上長期用藥帶來的問題。 目前，有研究表明使用表達(dá)-內(nèi)啡肽的重組腺病毒（Ad-NEP）對CCI大鼠模型的疼痛治療有著積極的意義。那么，如果使用Ad-NEP對骨癌痛大鼠進(jìn)行疼痛治療，是否也有積極的效果呢？本實(shí)驗(yàn)擬構(gòu)建攜帶-內(nèi)啡肽的重組腺病毒，并通過側(cè)腦室注射接種，轉(zhuǎn)染宿主室管膜細(xì)胞，長期高效地表達(dá)-內(nèi)啡肽，升高腦脊液中-內(nèi)啡肽的含量，經(jīng)由腦脊液循環(huán)直接作用于脊髓節(jié)段μ型阿片受體（MOR）。通過G蛋白介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)通路抑制神經(jīng)元從c-fos和c-jun基因的表達(dá)，從而抑制傷害性信號的上傳，增強(qiáng)抑制性調(diào)制系統(tǒng)的功能，改變神經(jīng)元的可塑性來提高痛閾。本研究試圖嘗試慢性癌痛病人的長期治療的新途徑，為進(jìn)一步研究腺病毒在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的轉(zhuǎn)染效率及其安全性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法 1.大鼠脛骨癌痛模型的建立和可行性評估 將實(shí)驗(yàn)大鼠分為腫瘤組，假手術(shù)組，和正常組三組。預(yù)先將Walker256大鼠乳腺癌細(xì)胞接種于剛斷奶的幼鼠腹腔中，于種植的第7天抽取幼鼠含有腫瘤細(xì)胞的腹水，分離提取，而后將此腹水混合液注入腫瘤組實(shí)驗(yàn)大鼠右側(cè)脛骨。假手術(shù)組注入滅活的腹水混合液，正常組大鼠不做處理。接種術(shù)后當(dāng)天、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22天，每天同樣的時間點(diǎn)，將三組實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行大鼠正常走動痛行為學(xué)評分（The score of ambulatory pain），輻射熱刺激測痛以及機(jī)械撤爪閾值（von Frey閾值）的行為學(xué)測定。各組大鼠于接種后第22天，于麻醉后，對其雙下肢進(jìn)行CT掃描。CT掃描條件：80KV，50MA，矩陣512×512，層厚0.7mm。觀察右側(cè)脛骨骨質(zhì)有無發(fā)生變化。以上實(shí)驗(yàn)遵從隨機(jī)雙盲原則。 2.大鼠側(cè)腦室注射表達(dá)β-內(nèi)啡肽的重組腺病毒（Ad-NEP）對腦脊液β-內(nèi)啡肽濃度的影響。 我們使用病毒滴度為5×1011PFU的非增殖型第一代基因重組腺病毒Ad-NEP，分別制備5×1010PFU、5×109PFU、5×108PFU、5×107PFU四種不同滴度容積為30l的待用病毒溶液。將實(shí)驗(yàn)SD大鼠分為6組，其中A組，B組，C組，D組，E組分別對應(yīng)5×107PFU，5×108PFU，5×109PFU，5×1010PFU，5×1011PFU五種不同滴度的Ad-NEP，F(xiàn)組為生理鹽水對照組。對應(yīng)組別將五種不同滴度的Ad-NEP分別注入相應(yīng)組別健康正常大鼠側(cè)腦室，在注射后第4天采集大鼠腦脊液并測定其中-EP濃度。同時，F(xiàn)組于對應(yīng)時間注射生理鹽水進(jìn)行對照。統(tǒng)計分析各個不同濃度組以及正常對照組的大鼠腦脊液-EP濃度值，將病毒滴度對數(shù)值與腦脊液-EP濃度值作相關(guān)性分析，推定適合大鼠側(cè)腦室注射的病毒滴度并討論表達(dá)物與所注射病毒滴度的相關(guān)性。 3.腺病毒Ad-NEP側(cè)腦室注射后對于骨癌痛大鼠疼痛的影響。 根據(jù)第二部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果制備滴度為5×109PFU的Ad-NEP。根據(jù)第一部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用walker256大鼠乳腺癌細(xì)胞建立大鼠脛骨癌痛模型。實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為Ad-NEP組（A組），對照組（B組）和正常組（C組）。前兩組實(shí)驗(yàn)動物均按照第一部分實(shí)驗(yàn)方法復(fù)制大鼠脛骨癌痛模型。而后在接種第10天Ad-NEP組大鼠側(cè)腦室注射5×109PFU的Ad-NEP，對照組注射等容量的生理鹽水。正常組大鼠不做任何處理。同時在接種含有腫瘤細(xì)胞的腹水手術(shù)后的當(dāng)天、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22天，每天同樣的時間點(diǎn)，將三組實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行測量體重，正常走動痛行為學(xué)評分（The score of ambulatory pain），輻射熱刺激測痛以及機(jī)械撤爪閾值（von Frey閾值）的行為學(xué)測定。此外，以側(cè)腦室注射日為0天，在側(cè)腦室注射Ad-NEP后的第2，4，8，12天，分別在當(dāng)日行為學(xué)評估之后進(jìn)行三組實(shí)驗(yàn)大鼠腦脊液的抽取，并使用放射免疫分析法（Radial Immunoassay，RIA）測定腦脊液標(biāo)本中-EP濃度。Ad-NEP組實(shí)驗(yàn)大鼠于接種后22天也就是側(cè)腦室注射后第12天，在進(jìn)行行為學(xué)測定以及腦脊液抽取后進(jìn)行腦組織的取材。取材之后標(biāo)本進(jìn)行切片，并熒光染色。以上實(shí)驗(yàn)遵從隨機(jī)雙盲原則。 結(jié)果 1.腫瘤組有兩只大鼠在術(shù)后第7天出現(xiàn)不可預(yù)見的死亡。假手術(shù)組自術(shù)后第二天其飲水進(jìn)食均正常，無出現(xiàn)死亡。在手術(shù)第1周，腫瘤組的體重和其他兩組無明顯區(qū)別，第2周開始腫瘤組體重增長慢于其他兩組，到第3周差距更加明顯。術(shù)后第6天始，腫瘤組15只大鼠中2只評分為3分。術(shù)后第18天，腫瘤組所有大鼠正常走動痛行為學(xué)評分均為1分。假手術(shù)組和正常組大鼠術(shù)后第2天開始觀察，步態(tài)正常，評分均為4分。對于大鼠輻射熱刺激測痛的行為學(xué)評估，通過測試，我們發(fā)現(xiàn)各組熱痛覺過敏潛伏期差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。對于大鼠機(jī)械撤爪閾值（von Frey閾值）的行為學(xué)測定，測試發(fā)現(xiàn)腫瘤組在行走痛行為學(xué)評分較高的早期，接種側(cè)后肢和對側(cè)后肢相比無統(tǒng)計學(xué)改變，但當(dāng)出現(xiàn)患側(cè)后足明顯不負(fù)重時，此時會出現(xiàn)2-3天的機(jī)械痛超敏期。同一只大鼠在接種后的早期，測得一穩(wěn)定的和基礎(chǔ)值相近的痛閾值。當(dāng)出現(xiàn)痛敏時，同樣條件測到的痛閾值和前者有明顯統(tǒng)計學(xué)差異（P0.01）。除此以外，機(jī)械性誘發(fā)痛覺超敏時期患側(cè)和對側(cè)的痛閾值也有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異（P0.05）。大鼠影像學(xué)結(jié)果，接種手術(shù)后第22天，腫瘤組有兩只大鼠CT掃面見腫瘤并未侵蝕右側(cè)脛骨，后行解剖發(fā)現(xiàn)腫瘤侵蝕右側(cè)脛骨外組織直至皮下。其余腫瘤組大鼠CT掃面均可見右側(cè)脛骨上段干骺端骨皮質(zhì)變薄，蟲蝕狀改變，透光性增加。假手術(shù)組及正常組均未發(fā)現(xiàn)有腫瘤侵蝕。 2. E組實(shí)驗(yàn)大鼠在側(cè)腦室注射后陸續(xù)全部死亡。其余4個實(shí)驗(yàn)組無實(shí)驗(yàn)大鼠死亡，并且這4個實(shí)驗(yàn)組組間數(shù)據(jù)均有顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P㩳0.01）。其中A、B組與正常對照組（F組）數(shù)據(jù)無顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；C、D組與正常對照組（F組）相比均有顯著差異（P㩳0.01）。 3.各組大鼠接種手術(shù)一周內(nèi)的體重?zé)o明顯區(qū)別，但從第二周開始A組B組體重增長慢于C組，到第三周，其差距更加明顯，側(cè)腦室注射后發(fā)現(xiàn)A，B兩組大鼠體重增長明顯慢于正常組，并且A，B兩組間體重增長無明顯區(qū)別（P0.05）。對于大鼠正常走動痛行為學(xué)評分，A組于第10天側(cè)腦室注射Ad-NEP后，于第12天起疼痛行為評分下降趨勢明顯小于B組（P0.05）。大鼠機(jī)械撤爪閾值（von Frey閾值）的行為學(xué)測定，我們發(fā)現(xiàn)從接種第12天起，也就是側(cè)腦室注射后第2天開始，不管是患側(cè)還是患肢對側(cè)，A組大鼠的痛閾相對于B組大鼠均有了顯著提高（P0.01）。這種顯著性差異患側(cè)一直持續(xù)到接種手術(shù)后第20天，患肢對側(cè)持續(xù)至第18天才消失。放射免疫分析法測定腦脊液標(biāo)本中-EP濃度的結(jié)果顯示，在側(cè)腦室注射5×109PFU滴度的Ad-NEP后第4天起A組大鼠的腦脊液-EP濃度大幅度提高。病毒注射組大鼠側(cè)腦室注射后第4天的大腦組織免疫熒光照片顯示，側(cè)腦室注射后，A組大鼠側(cè)腦室周邊致密分布著Ad-NEP的表達(dá)產(chǎn)物-EP。 結(jié)論 1.利用Walker256大鼠乳腺癌細(xì)胞可以成功構(gòu)建大鼠脛骨癌痛模型，并且易于復(fù)制。 2.容積30l，滴度5×109、5×1010PFU的重組腺病毒Ad-NEP是比較適合大鼠側(cè)腦室注射的病毒條件。此劑量可以使實(shí)驗(yàn)大鼠腦脊液獲得高濃度-EP，同時也不會在實(shí)驗(yàn)中造成實(shí)驗(yàn)大鼠大量死亡。 3.將容積30l，滴度5×109PFU的重組腺病毒Ad-NEP對Walker256大鼠乳腺癌細(xì)胞構(gòu)建的大鼠脛骨癌痛模型進(jìn)行側(cè)腦室注射，可以有效減輕骨癌痛大鼠的痛覺敏化，提高機(jī)械性刺激的痛閾，大大增加腦中-內(nèi)啡肽的濃度，從而改善骨癌痛大鼠的生存效果。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R738.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1666177