本文選題：高脂膳食　切入點：肥胖大鼠　出處：《上海體育學院》2016年博士論文

【摘要】：研究目的流行病學調(diào)查和動物實驗均已證實高脂膳食誘導肥胖會降低海馬內(nèi)神經(jīng)可塑性相關蛋白BDNF和突觸素(SYN)的表達,并損害海馬依賴的學習記憶能力,但其潛在的神經(jīng)生物學機制還未完全闡明。近幾年研究發(fā)現(xiàn),高脂膳食造成的能量過剩會誘發(fā)多種外周組織器官的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress,ERS),破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)翻譯后修飾、加工、合成等功能,而且ERS能影響細胞內(nèi)多條信號通路以調(diào)控細胞核內(nèi)的基因轉錄,在這兩方面的作用下會影響成熟蛋白質(zhì)的生物合成。但高脂膳食誘導SD大鼠肥胖后是否會引發(fā)其海馬ERS,海馬ERS能否調(diào)控神經(jīng)可塑性蛋白表達,這些問題均未見相關的研究報道。本研究通過建立高脂膳食誘導SD大鼠肥胖模型和有氧運動干預(在體實驗),并結合高糖脂干預原代培養(yǎng)的海馬細胞(離體實驗),對肥胖大鼠海馬ERS發(fā)生的可能機制、ERS調(diào)控BDNF和SYN生物合成的相關機制、有氧運動調(diào)節(jié)海馬ERS的可能機制等三方面的內(nèi)容展開系統(tǒng)研究,探究肥胖影響海馬內(nèi)BDNF和SYN表達的神經(jīng)生物學機制。研究方法研究一:7周齡雄性SD大鼠150只,普通飼料適應性喂養(yǎng)1周后,根據(jù)體重隨機分為兩組:(1)普通飼料組(normal chow diet,NCD組,n=40),大鼠給予普通飼料喂養(yǎng);(2)高脂飼料組(high fat diet,HFD組,n=110),大鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)。喂養(yǎng)8周后,以高脂飼料組大鼠體重大于等于普通飼料組大鼠平均體重加1.4倍標準差為標準來篩選高脂膳食誘導肥胖大鼠。肥胖建模后,根據(jù)體重隨機挑選NCD大鼠和肥胖大鼠并分為四組:普通飼料安靜對照組(normal diet control sedentary group,CS組,n=12)、普通飼料運動組(normal diet with aerobic exercise group,CE組,n=12),肥胖安靜組(obesity sedentary group,OS組,n=12),肥胖運動組(obesity with aerobic exercise group,OE組,n=12),各組大鼠維持其原有的膳食方式至實驗結束。運動組大鼠進行8周的中等強度有氧跑臺運動干預后,使用雙能X線檢測各組大鼠的脂肪重量和脂肪/體重比率。大鼠經(jīng)麻醉處死后,采集血液,并剝離出大腦兩側的海馬,用蛋白抽提試劑盒抽提海馬的膜蛋白、胞質(zhì)蛋白和核蛋白。使用分光光度計檢測大鼠血清中的血糖(Blood Glucose,BG)、甘油三酯(Triglyceride,TG)、總膽固醇(Total Cholesterol,TC)、低密度脂蛋白膽固醇(Low Density Lipoprotein Cholesterol,LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(High Density Lipoprotein Cholesterol,HDL-C)的含量,使用Western Blot檢測大鼠海馬內(nèi)如下蛋白的表達水平:轉運蛋白GLUT3和FATP1,ERS發(fā)生標志蛋白GRP78、p-PERK/PERK、p-IRE1α/IRE1α和p-e IF2α/e IF2α,ERS介導凋亡發(fā)生的標志蛋白caspase-12、CHOP,反應抗凋亡能力的蛋白Bcl-2/Bax,神經(jīng)可塑性蛋白BDNF和SYN,p38/ERK-CREB信號通路活化標志蛋白p-p38/p38、p-ERK/ERK、p-CREB/CREB,NLRP3-IL-1β信號通路活化標志蛋白NLRP3、IL-1β,Nrf2-HO-1信號通路活化標志蛋白Nrf2、HO-1。研究二:SPF級新生SD大鼠(出生2 d以內(nèi)),雌雄不限,分離出大腦海馬細胞并培養(yǎng)至成熟。配制高糖脂培養(yǎng)基、添加ERS抑制劑4-PBA的高糖脂培養(yǎng)基和添加Nrf2激動劑TBHQ的高糖脂培養(yǎng)基,用不同的培養(yǎng)基干預成熟的海馬細胞,通過觀察細胞的生長狀態(tài)和流式細胞儀檢測細胞存活率,確定不同培養(yǎng)基的最佳使用濃度和干預時間。之后實驗分為四組:(1)基礎培養(yǎng)基組(對照組),(2)高糖脂培養(yǎng)基組(基礎培養(yǎng)基中添加終濃度為50 m M葡萄糖和500μM棕櫚酸),(3)ERS抑制劑組(高糖脂培養(yǎng)基中添加終濃度為20 m M抑制劑4-PBA),(4)激動劑組(高糖脂培養(yǎng)基中添加終濃度為100μM的Nrf2的激動劑TBHQ),用不同的培養(yǎng)基干預海馬細胞6 h。用RT-PCR法檢測海馬細胞內(nèi)BDNF m RNA、SYN m RNA、NLRP3 m RNA、HO-1 m RNA的表達情況,用Western Blot檢測海馬細胞內(nèi)研究一中相關蛋白的表達情況。研究結果研究一:1.高脂飼料組大鼠經(jīng)8周高脂膳食后,其體重顯著高于普通飼料組大鼠(p0.01),符合肥胖標準的大鼠有63只,肥胖建模成功率為57.27%(63/110)。與普通飼料組大鼠相比,肥胖大鼠血清中BG、TG、TC和LDL-C的濃度顯著升高(p0.01),HDL-C濃度顯著降低(p0.01)。2.經(jīng)8周有氧運動干預后,OE組大鼠的攝食量、能量攝入、體重、全身脂肪重量和脂肪/體重比率均顯著低于OS組大鼠(p0.05,p0.01),血清中的血糖和TG、TC和LDL-C的濃度濃度也顯著降低(p0.01),HDL-C濃度顯著升高(p0.01)。3.OS組大鼠海馬內(nèi)GLUT3和FATP1蛋白表達水平顯著高于CS組大鼠(p0.01),而OE組大鼠海馬內(nèi)這兩種轉運蛋白的表達水平顯著低于OS組大鼠(p0.01)。與CS組大鼠相比,CE組大鼠海馬內(nèi)GLUT3表達水平顯著升高(p0.01),但FATP1表達水平?jīng)]有發(fā)生顯著性變化。4.與CS組大鼠相比,OS組大鼠海馬內(nèi)ERS發(fā)生的標志蛋白GRP78、p-PERK、p-IRE1α和p-e IF2α的含量顯著升高(p0.01),ERS介導凋亡的caspase-12、CHOP及Bax的含量顯著升高(p0.01),Bcl-2的含量顯著降低(p0.01)。與OS組大鼠相比,OE組大鼠海馬內(nèi)ERS發(fā)生的標志蛋和ERS介導凋亡發(fā)生的標志蛋白的表達水平均顯著降低(p0.01)。5.OS組大鼠海馬內(nèi)pro BDNF、BDNF和SYN的表達水平顯著低于CS組大鼠(p0.01),CE組大鼠海馬內(nèi)這些神經(jīng)可塑性蛋白的表達水平顯著高于OS組大鼠(p0.01)。與CS組大鼠相比,CE組大鼠海馬內(nèi)這些神經(jīng)可塑性蛋白的表達水平也顯著性升高(p0.05)。6.與CS組大鼠相比,OS組大鼠海馬內(nèi)p38、ERK和CREB的磷酸化水平顯著降低(p0.01),NLRP3和IL-1β的含量顯著升高(p0.01)。與OS組大鼠相比,OE組大鼠海馬內(nèi)p38、ERK和CREB的磷酸化水平顯著升高(p0.01),而上述兩種炎癥蛋白的含量顯著下降(p0.01)。與CS組大鼠相比,CE組大鼠海馬內(nèi)上述三種蛋白的磷酸化水平也顯著性升高(p0.05),上述兩種炎癥蛋白的含量也顯著性下降(p0.05)。7.OS組大鼠海馬內(nèi)Nrf2和HO-1的表達水平顯著低于CS組大鼠(p0.01),而OE組大鼠海馬內(nèi)這兩種蛋白的表達水平顯著升高(p0.01)。與CS組大鼠相比,CE組大鼠海馬內(nèi)這兩種蛋白的表達水平也顯著升高(p0.01)。研究二:1.由50 m M葡萄糖和500μM棕櫚酸配成的高糖脂培養(yǎng)基干預海馬細胞后,GLUT3和FATP1的蛋白表達水平顯著高于基礎培養(yǎng)基組(p0.01),高糖脂培養(yǎng)基中使用ERS抑制劑或Nrf2的激動劑后與高糖脂培養(yǎng)基組相比,這兩種糖脂轉運蛋白的表達水平并未發(fā)生顯著性變化。2.與基礎培養(yǎng)基組相比,高糖脂培養(yǎng)基組海馬細胞內(nèi)GRP78、p-PERK、p-IRE1α和p-e IF2α的表達水平顯著升高(p0.01),caspase-12、CHOP和Bax等促凋亡蛋白的含量顯著升高(p0.01),抗凋亡蛋白Bcl-2的含量顯著降低(p0.01)。使用ERS抑制劑或Nrf2的激動劑后,與高糖脂培養(yǎng)基組相比,除激動劑組海馬細胞內(nèi)Bax表達水平未發(fā)生顯著性變化外,ERS及其介導的凋亡的發(fā)生程度均顯著降低(p0.01),抑制劑組和激動劑組海馬細胞Bcl-2的含量均顯著增加(p0.01)。3.與基礎培養(yǎng)基組相比,高糖脂培養(yǎng)基組海馬細胞內(nèi)pro BDNF、BDNF和SYN的表達水平均顯著降低(p0.01)。高糖脂培養(yǎng)基中添加ERS抑制劑或Nrf2的激動劑后,這三種蛋白的含量均顯著增加(p0.01)。4.高糖脂培養(yǎng)基組海馬細胞內(nèi)p38、ERK和CREB的磷酸化水平顯著低于基礎培養(yǎng)基組(p0.01),BDNF和SYN的m RNA表達水平也顯著降低(p0.01)。高糖脂培養(yǎng)基中添加ERS抑制劑或Nrf2的激動劑后,這三種蛋白的磷酸化水平和BDNF、SYN的基因表達水平均顯著上升(p0.01)。5.與基礎培養(yǎng)基組相比,高糖脂培養(yǎng)基組海馬細胞內(nèi)NLRP3炎癥小體和IL-1β的蛋白含量顯著增加(p0.05,p0.01),NLRP3 m RNA表達水平也顯著增加(p0.01)。使用ERS抑制劑或Nrf2的激動劑后,與高糖脂培養(yǎng)基組相比,這兩種炎性蛋白的表達水平及NLRP3 m RNA的表達水平均顯著降低(p0.01)。6.高糖脂培養(yǎng)基組海馬細胞內(nèi)Nrf2和HO-1的蛋白含量及HO-1 m RNA表達水平均顯著低于基礎培養(yǎng)基組(p0.01),使用ERS抑制劑后,這兩種蛋白的含量及HO-1 m RNA的表達水平均未發(fā)生顯著性變化;但使用Nrf2的激動劑后,這兩種蛋白的含量及HO-1 m RNA的表達水平均顯著增加(p0.01)。結論:1.8周的高脂膳食能誘導SD大鼠肥胖,使其出現(xiàn)糖脂代謝紊亂的癥狀,高糖脂能促進海馬內(nèi)GLUT3和FATP1的蛋白表達。2.高脂膳食誘導肥胖后產(chǎn)生的高血糖、高血脂等能誘發(fā)大鼠海馬ERS,這不僅能破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白合成功能,而且海馬ERS還能負向調(diào)控p38/ERK-CREB信號通路,正向調(diào)控NLRP3-IL-1β信號通路,并引起細胞凋亡,由此降低BDNF和SYN的生物合成。3.8周的有氧運動干預能改善肥胖大鼠糖脂代謝紊亂,降低海馬內(nèi)GLUT3和FATP1的蛋白表達,并能激活海馬內(nèi)Nrf2-HO-1信號轉導通路,由此降低海馬ERS及其介導凋亡的發(fā)生程度,進而增加BDNF和SYN的生物合成。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：上海體育學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R589.2
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本文編號：1660786