本文選題：氧化應(yīng)激　切入點(diǎn)：帕瑞昔布　出處：《安徽醫(yī)科大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：術(shù)后認(rèn)知功能障礙(postoperative cognitive dysfunction, POCD)是指麻醉及手術(shù)后數(shù)天至數(shù)月內(nèi)發(fā)生的并發(fā)癥,常發(fā)生于老年術(shù)后病人,主要表現(xiàn)為急性精神紊亂綜合征,如意識(shí)水平、認(rèn)知能力、定向思維、學(xué)習(xí)記憶以及睡眠等方面的紊亂,輕者持續(xù)時(shí)間短,可自愈,嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致傷口愈合延遲、并發(fā)癥增多、住院天數(shù)延長(zhǎng)、醫(yī)療費(fèi)用增加等,甚至影響病人出院后的生活質(zhì)量以及死亡率增加,目前確切病因仍不很明確,給臨床預(yù)防和治療POCD帶來(lái)一定的困難。已有的研究表明POCD的發(fā)生與手術(shù)因素、年齡因素、麻醉用藥、預(yù)先存在的腦、心臟、血管疾病、低教育水平和術(shù)后并發(fā)癥等多種因素有關(guān),此外,氧化應(yīng)激在大腦中,特別是在海馬組織可能參與POCD的發(fā)病機(jī)制。氧化應(yīng)激被認(rèn)為是參與大腦急性病理狀態(tài)的細(xì)胞損傷過(guò)程和許多退行性疾病如阿爾茨海默病的神經(jīng)病理學(xué)改變。氧化應(yīng)激相關(guān)的細(xì)胞損傷潛在的分子機(jī)制仍未完全闡明。目前POCD日益受到研究者的關(guān)注。如何早期預(yù)測(cè)與發(fā)現(xiàn)可能出現(xiàn)POCD的患者,并給予及時(shí)的預(yù)防與治療,是提高患者生活質(zhì)量的關(guān)鍵所在,尋找新的治療靶點(diǎn)以改善患者的預(yù)后成為目前研究的焦點(diǎn)。星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocyte, AS)作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)在數(shù)量上占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的大膠質(zhì)細(xì)胞,廣泛地分布于神經(jīng)元之間,不僅為神經(jīng)元提供能量和代謝的支持,而且在形成和維持血腦屏障、調(diào)節(jié)突觸可塑性等方面發(fā)揮重要作用。作為大腦支持性和代謝細(xì)胞,星形膠質(zhì)細(xì)胞是大腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system, CNS)的關(guān)鍵細(xì)胞,參與細(xì)胞外環(huán)境的維護(hù)和生理及病理?xiàng)l件下細(xì)胞間通訊的穩(wěn)定]。星形膠質(zhì)細(xì)胞為神經(jīng)元提供機(jī)械和代謝支持。許多功能都與星形膠質(zhì)細(xì)胞密切相關(guān),包括離子體內(nèi)平衡,調(diào)節(jié)細(xì)胞外谷氨酸濃度以及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的合成,參與大腦的生理抗氧化防御等。帕瑞昔布,非甾體類(lèi)抗炎藥(nonsteriodial anti-inflammatory drug, NSAID),可選擇性地阻斷環(huán)氧化酶-2 (cyclooxygenase-2, COX-2)的作用,在術(shù)后疼痛的研究中備受關(guān)注。近年來(lái)研究表明,帕瑞昔布有神經(jīng)保護(hù)作用,但迄今為止仍缺乏相關(guān)具體機(jī)制的研究。帕瑞昔布對(duì)過(guò)氧化氫(hydrogen peroxide, H2O2)誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)的大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響鮮有研究。如果有保護(hù)作用的話(huà),帕瑞昔布不但可以作為止痛劑,同時(shí)可以改善氧化應(yīng)激反應(yīng)對(duì)POCD的影響。本研究給予原代培養(yǎng)的大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞強(qiáng)氧化劑H202處理,造成氧化損傷,建立氧化應(yīng)激模型�；诖四Ｐ�,研究帕瑞昔布對(duì)H202誘導(dǎo)的星型膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)保護(hù)作用,并進(jìn)一步探討其保護(hù)作用機(jī)制。論文共分兩部分：第一部分探討大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng)及星形膠質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激模型的建立；第二部分證實(shí)帕瑞昔布減輕H202誘導(dǎo)的大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的作用并探討其作用機(jī)制。第一部分大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng)及星形膠質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激模型的建立目的：探究大鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞的分離、純化及體外培養(yǎng)方法,加入H202引起星形膠質(zhì)細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷,建立氧化應(yīng)激模型,為進(jìn)一步深入研究氧化應(yīng)激損傷,篩選有效的抗氧化神經(jīng)保護(hù)劑提供重要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法：采用新生SD大鼠海馬進(jìn)行星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。無(wú)菌條件下取出生后12～24 h的SD大鼠海馬組織,剪碎組織后用胰蛋白酶消化,結(jié)合吸管機(jī)械吹打?qū)⒓?xì)胞打散,離心后用DMEM/F12混合培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液,接種在無(wú)底物黏附的玻璃培養(yǎng)瓶中,置37℃,5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將培養(yǎng)9～12d的細(xì)胞,置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中,37℃,200r/min,培養(yǎng)12 h。倒除含有脫落細(xì)胞的懸液,并用D-Hank's平衡鹽液洗滌細(xì)胞兩次,目的是去除小膠質(zhì)及少突膠質(zhì)細(xì)胞等干擾細(xì)胞,并且加入含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),待細(xì)胞恢復(fù)正常并進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后傳代培養(yǎng),并進(jìn)行膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)抗體免疫組化鑒定。100μmol/LH2O2作用星形膠質(zhì)細(xì)胞24 h,四甲基噻唑氮藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)法進(jìn)行細(xì)胞活力分析；倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)改變；2’,7’-二氯熒光素二乙酸酯(2,7-dichlordi-hydrofluorescein, DCFH-DA)熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species, ROS)含量。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。結(jié)果：通過(guò)恒溫震蕩和傳代后得到了形態(tài)典型,含量較高的大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞。經(jīng)GFAP染色,原代培養(yǎng)的第一代星形膠質(zhì)細(xì)胞,GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)達(dá)85%以上；第二代星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)后GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)達(dá)90%以上,第三代細(xì)胞GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)達(dá)98%以上,均為胞漿著色,胞核未見(jiàn)著色,獲得純度較高的星形膠質(zhì)細(xì)胞,可用于實(shí)驗(yàn),本實(shí)驗(yàn)使用第四代到第七代星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行研究。H202干預(yù)組星形膠質(zhì)細(xì)胞與對(duì)照組相比,細(xì)胞活力下降,細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化,失去結(jié)構(gòu)完整性,部分細(xì)胞死亡,漂浮在正常細(xì)胞層上面。ROS檢測(cè)發(fā)現(xiàn),H202組熒光強(qiáng)度增強(qiáng),ROS生成增多。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡發(fā)現(xiàn),H202處理組細(xì)胞凋亡率明顯增加。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)成功進(jìn)行了大鼠海馬組織原代星形膠質(zhì)細(xì)胞的分離、純化、體外培養(yǎng)及鑒定,建立了原代SD大鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞體系。使用H202引起星形膠質(zhì)細(xì)胞氧化損傷,造成氧化應(yīng)激模型,為進(jìn)一步觀察藥物對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激的保護(hù)作用打下基礎(chǔ)。第二部分帕瑞昔布減輕過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的作用及機(jī)制研究目的：探討帕瑞昔布對(duì)H202誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)的大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響,并為帕瑞昔布的臨床腦保護(hù)作用提供理論依據(jù)。方法：80μmol/L和160μmol/L的帕瑞昔布預(yù)處理大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞24 h后,再加入100μmol/L H2O2作用24 h,MTT法進(jìn)行細(xì)胞活力分析；倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)改變,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS含量,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,免疫組化檢測(cè)水通道蛋白4 (aquaporin 4, AQP4)蛋白表達(dá)情況,逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)檢測(cè)Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2-assotiated X protein, bax)、B細(xì)胞淋巴瘤-2 (B-celllymphoma-2, bcl-2) mRNA的表達(dá),蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blot, WB)檢測(cè)腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子(brain derived neurotrophic factor, BDNF)蛋白的表達(dá)。結(jié)果：MTT結(jié)果顯示,帕瑞昔布預(yù)處理組吸光度值明顯增加,與H202組相比,細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率明顯改善,帕瑞昔布預(yù)處理組與正常對(duì)照組相比無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。倒置顯微鏡下觀察帕瑞昔布預(yù)處理組與H202組相比,細(xì)胞形態(tài)基本完整,大部分細(xì)胞突起依然存在。流式細(xì)胞儀進(jìn)行ROS檢測(cè),H202組與對(duì)照組相比,熒光強(qiáng)度增強(qiáng),ROS生成明顯增多,而帕瑞昔布預(yù)處理組能明顯阻止星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)ROS水平增加,其中160μmol/L帕瑞昔布預(yù)處理組細(xì)胞內(nèi)ROS水平與H202組有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。H202處理組星形膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡率與對(duì)照組相比明顯增加,而帕瑞昔布組預(yù)處理可明顯減少細(xì)胞凋亡率,與H202組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。免疫組化結(jié)果顯示：H202組星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)AQP4蛋白表達(dá)明顯升高,而80μmol/L和160 μmol/L帕瑞昔布預(yù)處理組AQP4蛋白表達(dá)與H202組相比明顯下降。]RT-PCR結(jié)果表明：H202組星形膠質(zhì)細(xì)胞bax mRNA表達(dá)明顯增加,bcl-2 mRNA表達(dá)明顯降低,而160μmol/L帕瑞昔布預(yù)處理組baxmRNA表達(dá)較H202組減少,bcl-2 mRNA表達(dá)明顯增加。Western blot結(jié)果表明H202組星形膠質(zhì)細(xì)胞BDNF蛋白表達(dá)較對(duì)照組相比明顯減少,而帕瑞昔布預(yù)處理組BDNF蛋白表達(dá)較H202組明顯增加。結(jié)論：帕瑞昔布對(duì)H202誘導(dǎo)的大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞氧化損傷具有保護(hù)作用,其機(jī)制可能與降低細(xì)胞ROS水平,減少細(xì)胞凋亡率,抑制AQP4表達(dá),減少bax表達(dá),增加bcl-2和BDNF表達(dá)有關(guān)。這表明帕瑞昔布可能發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R614

【參考文獻(xiàn)】

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1 Yun-zhi LING;Wei MA;Li YU;Ye ZHANG;Qi-sheng LIANG;;七氟烷麻醉誘導(dǎo)的認(rèn)知功能損傷與內(nèi)測(cè)前額葉皮層中PSD95表達(dá)量降低有關(guān)（英文）[J];Journal of Zhejiang University-Science B(Biomedicine & Biotechnology);2015年09期

2 陳學(xué)均;李鵬;徐廣民;;帕瑞昔布對(duì)老年膝關(guān)節(jié)置換患者血漿炎癥因子及早期認(rèn)知功能影響[J];重慶醫(yī)學(xué);2015年06期

3 駱鵬飛;莢衛(wèi)東;許戈良;穆夏黎;馬金良;葛勇勝;;帕瑞昔布鈉對(duì)老年肝癌肝切除患者術(shù)后認(rèn)知功能的影響[J];中國(guó)普通外科雜志;2014年07期

4 施麗娟;劉志平;朱珊珊;陳偉鋒;羅慧君;沈逸飛;;帕瑞昔布鈉聯(lián)合鎮(zhèn)痛對(duì)老年人硬膜外麻醉術(shù)后認(rèn)知功能的影響[J];中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥;2014年19期

5 Su Liu;Guangyu Shen;Shukun Deng;Xiubin Wang;Qinfeng Wu;Aisong Guo;;Hyperbaric oxygen therapy improves cognitive functioning after brain injury[J];Neural Regeneration Research;2013年35期

6 鄭艇;鄭春英;吳曉丹;鄭曉春;甘秀峰;陳彥青;;帕瑞昔布鈉對(duì)單肺通氣患者肺內(nèi)分流及氧化應(yīng)激水平的影響[J];中國(guó)急救醫(yī)學(xué);2013年12期

7 Sung Min Nam;Yo Na Kim;Dae Young Yoo;Sun Shin Yi;Jung Hoon Choi;In Koo Hwang;Je Kyung Seong;Yeo Sung Yoon;;Hypothyroidism affects astrocyte and microglial morphology in type 2 diabetes[J];Neural Regeneration Research;2013年26期

8 宗惠花;陸洲;張征仙;湯亞文;;堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷研究[J];現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生;2013年08期

9 胡惠英;李斌;張傳漢;李建華;程磊;吳壇光;;帕瑞昔布鈉聯(lián)合鎮(zhèn)痛對(duì)乳腺癌患者術(shù)后炎癥及應(yīng)激反應(yīng)的影響[J];臨床麻醉學(xué)雜志;2012年04期

10 胡憲文;張野;謝春林;吳云;翁立軍;蔣玲玲;陳齊;李云;;帕瑞昔布鈉對(duì)骨科患者術(shù)后舒芬太尼靜脈鎮(zhèn)痛效果的影響[J];安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2012年04期

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本文編號(hào)：1657919