本文選題：慢性創(chuàng)面　切入點(diǎn)：放射損傷的脂肪源性干細(xì)胞　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景 慢性創(chuàng)面在臨床上比較棘手。過(guò)去已經(jīng)進(jìn)行了大量的工作以促進(jìn)慢性創(chuàng)面的愈合。但是,由于缺乏與人類病理生理學(xué)相似的前期的動(dòng)物模型,慢性創(chuàng)面的新治療方法的研究進(jìn)展受到阻礙。為了研究各種實(shí)驗(yàn)治療因素的潛在效應(yīng),既往已經(jīng)成立了各種慢性創(chuàng)面的動(dòng)物模型。由于豬和人類的解剖學(xué)和生物學(xué)的相似性,甚至是對(duì)電離輻射的時(shí)間和劑量依賴性的反應(yīng)的相似性,因此豬是慢性創(chuàng)面模型的最佳實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)象。既往已經(jīng)有用約克郡豬和尤卡坦豬制作慢性創(chuàng)面模型的相關(guān)文獻(xiàn)。但不足之處在于如果豬的生長(zhǎng)速度太快,將影響實(shí)驗(yàn)治療因素的研究結(jié)果,因?yàn)椴煌挲g的豬全厚創(chuàng)面愈合的速度和細(xì)胞因子的水平是不同的。另外,放射后選擇什么時(shí)候作為制作慢性創(chuàng)面模型更為合適呢? 既往的文獻(xiàn)報(bào)道了體外實(shí)驗(yàn)中,低劑量的激光輻射能對(duì)人脂肪干細(xì)胞產(chǎn)生積極的影響。眾多文獻(xiàn)記錄了諸如神經(jīng)干細(xì)胞,間質(zhì)干細(xì)胞,造血干細(xì)胞等人類干細(xì)胞對(duì)電離輻射的反應(yīng)和特征變化。人骨髓源性干細(xì)胞能夠保持它們的干細(xì)胞特征。然而,這些實(shí)驗(yàn)基本上都是在體外以及低劑量的輻射條件下(10Gy)進(jìn)行的,很少有在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)以及高劑量的電離輻射條件下進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)報(bào)道。因此,我們的第二個(gè)實(shí)驗(yàn)假想是,在電離輻射后的不同時(shí)期,比較活體內(nèi)的放射損傷脂肪干細(xì)胞與正常的脂肪干細(xì)胞的不同。 脂肪干細(xì)胞分泌許多潛在的有利于創(chuàng)面愈合的生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子。本實(shí)驗(yàn)中,我們通過(guò)放射依據(jù)放射后的不同時(shí)間在小型豬身上制作慢性創(chuàng)面模型,然后在慢性創(chuàng)面進(jìn)行自體脂肪干細(xì)胞移植,比較自體脂肪干細(xì)胞和空白對(duì)照液對(duì)慢性創(chuàng)面愈合的效果。 目的 1、采用小型豬,通過(guò)放射即電離輻射,根據(jù)放射后的不同時(shí)間點(diǎn),分別比較放射后2周、4周和6周的情況,來(lái)創(chuàng)建一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化的慢性創(chuàng)面模型,以利于對(duì)慢性創(chuàng)面愈合的實(shí)驗(yàn)研究。 2、比較放射后2周、4周和6周分離獲取的活體內(nèi)放射損傷的脂肪干細(xì)胞(r-ADSCs)和正常脂肪干細(xì)胞(n-ADSCs)兩者的增殖能力、分化能力以及免疫分型,了解大劑量的電離輻射對(duì)活體內(nèi)脂肪干細(xì)胞的影響。 3、在由放射誘導(dǎo)的慢性創(chuàng)面,使用自體脂肪源性干細(xì)胞的局部注射移植,檢驗(yàn)單一使用自體脂肪干細(xì)胞對(duì)慢性創(chuàng)面模型的效應(yīng)。 方法 一、小型豬背部的放射的實(shí)施及其優(yōu)化實(shí)驗(yàn) 經(jīng)過(guò)替來(lái)他明-唑拉西泮注射液(Zoletil(?); Virbac Laboratories, Carros, France)和鹽酸甲苯噻嗪注射液(Rompun(?); Bayer, Lerverkusen, Germany)的注射,麻醉起效后,將豬運(yùn)送至腫瘤放射治療科。在每一頭豬的背上選取三個(gè)大小為18×8cm的區(qū)域,暴露于直線加速器下,每一個(gè)區(qū)域接受劑量為18Gy的單次照射。照射完畢后,將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物豬運(yùn)送到動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,并在標(biāo)準(zhǔn)條件下飼養(yǎng)兩周。 二、正常脂肪干細(xì)胞(n-ADSCs)和放射損傷脂肪干細(xì)胞(r-ADSCs)的準(zhǔn)備 在建立創(chuàng)面模型時(shí),在脊柱旁的非放射區(qū)域和放射區(qū)域,從切除的組織獲取皮下脂肪組織,分別用以分離培養(yǎng)正常脂肪干細(xì)胞(n-ADSCs)和放射損傷脂肪干細(xì)胞(r-ADSCs).將切下來(lái)的脂肪組織清洗,剁碎,Ⅰ型膠原蛋白酶消化,離心,細(xì)胞團(tuán)懸浮,過(guò)濾,再次離心,最后將細(xì)胞種植在100(?)的培養(yǎng)皿中,置于37℃并含有5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)。定期更換細(xì)胞培養(yǎng)液。第一代的脂肪干細(xì)胞凍存?zhèn)溆谩Ｅ囵B(yǎng)至第三代的自體脂肪干細(xì)胞用于干細(xì)胞移植以治療創(chuàng)面。依據(jù)創(chuàng)面建立的時(shí)間,放射損傷脂肪干細(xì)胞(r-ADSCs)分為三個(gè)組：(1)放射后2周獲取的放射損傷脂肪干細(xì)胞組(2R組),(2)放射后4周獲取的放射損傷脂肪干細(xì)胞組(4R組),(3)放射后6周獲取的放射損傷脂肪干細(xì)胞組(6R組)。類似的,正常脂肪干細(xì)胞(n-ADSCs)也分為三個(gè)組：(1)放射后2周獲取的正常脂肪干細(xì)胞組(2N組),(2)放射后4周獲取的正常脂肪干細(xì)胞組(4N組),(3)放射后6周獲取的正常脂肪干細(xì)胞組(6N組)。 三、放射損傷脂肪干細(xì)胞(r-ADSCs)和正常脂肪干細(xì)胞(n-ADSCs)的分析比較 對(duì)放射2周組(2R組),放射4周組(4R組),放射6周組(6R組),正常2周組(2N組),正常4周組(4N組),正常6周組(6N組)的脂肪干細(xì)胞進(jìn)行以下比較分析：1.采用CCK-8細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒進(jìn)行細(xì)胞增殖能力的分析比較,并通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀描記結(jié)果以繪出細(xì)胞生長(zhǎng)曲線；2.β-牛乳糖關(guān)聯(lián)的細(xì)胞老化分析(Senescence-associated β-galactosidase);3.細(xì)胞菌落集成分析(Colony Forming Units-Fs分析)；4.免疫表型分析,包括CD31,CD45,CD29,CD90;5.脂肪分化能力和成骨分化能力的分析。 四、創(chuàng)面模型的建立和自體脂肪干細(xì)胞的在實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面的注射移植 每一只小型豬總共有3次創(chuàng)面模型的建立,即分別在：(1)電離放射后2周,(2)電離放射后4周,(3)電離放射后6周。即是說(shuō),依據(jù)創(chuàng)面建立的時(shí)間,創(chuàng)面分為三個(gè)大組：(1)放射后2周建立的放射創(chuàng)面和放射后2周建立的正常創(chuàng)面,(2)放射后4周建立的放射創(chuàng)面和放射后4周建立的正常創(chuàng)面,(3)放射后6周建立的放射創(chuàng)面和放射后6周建立的正常創(chuàng)面。每一次創(chuàng)面模型的建立,每一只豬有三個(gè)創(chuàng)面形成,其中包括兩個(gè)放射創(chuàng)面和一個(gè)正常創(chuàng)面。前者,即兩個(gè)放射創(chuàng)面將在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中被隨機(jī)分成未接受自體脂肪干細(xì)胞注射移植的陽(yáng)性對(duì)照組和接受自體脂肪干細(xì)胞注射移植的實(shí)驗(yàn)組。每一個(gè)創(chuàng)面的大小為邊長(zhǎng)4cm的正方形,創(chuàng)面邊緣距離放射區(qū)域的邊界為2cm,兩個(gè)創(chuàng)面間隔為6cm。標(biāo)記于脊柱另一側(cè)的非放射區(qū)域的正常的創(chuàng)面為陰性對(duì)照組。建立創(chuàng)面時(shí),切除的組織包括皮膚和淺層脂肪組織,不包括深層脂肪組織,創(chuàng)面的深度大約為1.5至2.0cmm。 總共有18個(gè)創(chuàng)面,其中6個(gè)正常創(chuàng)面,12個(gè)放射創(chuàng)面。從12個(gè)放射創(chuàng)面中再隨機(jī)選擇出一半接受脂肪干細(xì)胞移植的放射創(chuàng)面,以接受自體脂肪源性干細(xì)胞的注射移植。注射部位位于距離創(chuàng)面邊緣大約5mm的真皮和淺層脂肪層之間的皮下區(qū)域,所有接受自體脂肪干細(xì)胞移植的創(chuàng)面分別在創(chuàng)面建立后4周和6周各接受干細(xì)胞移植一次。每一次接受注射移植的細(xì)胞數(shù)量大約為10×106個(gè)/2ml DMEM (1×106-2×106cells/1cm2創(chuàng)面)。 為了測(cè)試各個(gè)創(chuàng)面組的愈合速度,在建立創(chuàng)面后開(kāi)始每周用數(shù)碼相機(jī)對(duì)每個(gè)創(chuàng)面進(jìn)行拍照。然后將相片上傳至計(jì)算機(jī),用Visitrak創(chuàng)面分析儀(SmithNephew, Australia)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。 在脂肪干細(xì)胞移植治療前,對(duì)建立于放射后第2,4,6周的放射創(chuàng)面和正常創(chuàng)面,在創(chuàng)面建立后0,2,4周分別取活組織檢查。最后在創(chuàng)面建立后9周,對(duì)未接受自體脂肪干細(xì)胞移植的放射創(chuàng)面組,接受自體脂肪干細(xì)胞移植的放射創(chuàng)面組,正常創(chuàng)面組進(jìn)行活組織檢查。切片用蘇木精和曙紅(HE)染色,以進(jìn)行常規(guī)的組織學(xué)分析。五、統(tǒng)計(jì)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)量資料的數(shù)據(jù)采用(x±s)表示。關(guān)于電離輻射對(duì)脂肪干細(xì)胞的影響的分析采用one-way ANOVA方法進(jìn)行多樣本均數(shù)比較,先做方差齊性檢驗(yàn),若方差齊,各組間存在差異,則采用LSD法和Bonferroni法檢驗(yàn)法進(jìn)行組間多重比較；方差不齊,采用Welch檢驗(yàn),若各組間存在差異,采用Dunnett T3檢驗(yàn)法進(jìn)行組間多重比較,以P0.05示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。關(guān)于創(chuàng)面的數(shù)據(jù)分析采用重復(fù)測(cè)量法(Repeated Measures)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。若有交互效應(yīng)則進(jìn)一步進(jìn)行單獨(dú)效應(yīng)分析,即固定時(shí)間點(diǎn),組間比較采用單因素方差分析,多重比較采用LSD方法；固定組別,不同時(shí)間點(diǎn)之間的比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析,多重比較采用LSD方法。P值0.05時(shí)認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)果 一、放射損傷脂肪干細(xì)胞(r-ADSCs)和正常脂肪干細(xì)胞(n-ADSCs)的分析比較 1、細(xì)胞增殖能力 結(jié)晶紫染色后,放射6周組(6R)的細(xì)胞形態(tài)不均一且明顯變小,而放射2周組(2R)、放射4周組(4R)、正常2周組(2N)、正常4周組(4N)、正常6周組(6N)之間相似(圖2-1.A)。從細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線上看,放射2周組(2R)和放射4周組(4R)的細(xì)胞生長(zhǎng)速度相似。僅在培養(yǎng)后第9天(F=13.545,P=0.002)和第15天(F=339.589,P=0.000),放射4周組(4R)的細(xì)胞生長(zhǎng)顯著慢于正常組和放射2周組(2R)(第9天：P=0.022和P=0.036,第15天：P=0.006和P=0.002),在第21,27,30天,放射4周組與正常組和放射2周組組間無(wú)顯著差異。在第21天時(shí)(F=12.003,P=0.002),放射6周組(6R)的細(xì)胞生長(zhǎng)速度與正常組、放射2周組(2R)、放射4周組(4R)相比較顯著性的減弱(P=0.000,P=0.020和P=0.001)。在第27天時(shí)(F=1.953,P=0.200),放射6周組(6R)的細(xì)胞生長(zhǎng)速度與正常組、放射2周組(2R)、放射4周組(4R)相比較顯著性的減弱(P=0.004,P=0.039和P==0.048)。在第30天時(shí)(F=0.579,P=0.645),放射6周組(6R)的細(xì)胞生長(zhǎng)速度與正常組、放射2周組(2R)、放射4周組(4R)相比較顯著性的減弱(P=0.000,P=0.000和P=0.001)(圖2-1.E,表1)。CCK-8分析結(jié)果顯示,在含10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液中,正常組的脂肪干細(xì)胞在培養(yǎng)第5天(F=1.623,P=0.229)的增殖速度顯著快于放射2周組(2R)、放射4周組(4R)和放射6周組(6R)(P=0.032,P=0.013和P=0.026)；正常組的脂肪干細(xì)胞在培養(yǎng)第7天(F=1.104,P=0.380)的增殖速度顯著快于放射2周組(2R)、放射4周組(4R)和放射6周組(6R)(P=0.009,P=0.001和P==0.000)；正常組的脂肪干細(xì)胞在培養(yǎng)第9天(F=2.208,P=0.124)的增殖速度顯著快于放射2周組(2R)、放射4周組(4R)和放射6周組(6R)(P=0.018,P=0.028和P=0.000)；正常組的脂肪干細(xì)胞在培養(yǎng)第11天(F=0.577,P=0.640)的增殖速度顯著快于放射2周組(2R)、放射4周組(4R)和放射6周組(6R)(P=0.000,P=0.013和P=0.000)(圖2-1.F,表2)。在放射2周組(2R)、放射4周組(4R)和放射6周組(6R)三者之間在培養(yǎng)第5,7,9,11天的增殖速度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。同時(shí),在用含1%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液作為細(xì)胞壓力測(cè)試的過(guò)程中,放射6周組的細(xì)胞增殖速度則顯著快于正常組、放射2周組、放射4周組：放射6周組(6R)的脂肪干細(xì)胞在培養(yǎng)第1天(F=1.044,P=0.404)的增殖速度顯著快于正常組(N)、放射2周組(2R)和放射4周組(4R)(P=0.000, P=0.000和P=0.001)；放射6周組(6R)的脂肪干細(xì)胞在培養(yǎng)第3天(F=0.858,P=0.485)的增殖速度顯著快于正常組(N)、放射2周組(2R)和放射4周組(4R)(P=0.000,P=0.000和P=0.000)；放射6周組(6R)的脂肪干細(xì)胞在培養(yǎng)第5天(F=1.049,P=0.402)的增殖速度顯著快于正常組(N)、放射2周組(2R)和放射4周組(4R)(P=0.000,P=0.000和P=0.000)；放射6周組(6R)的脂肪干細(xì)胞在培養(yǎng)第7天(F=0.964,P=0.437)的增殖速度顯著快于正常組(N)、放射2周組(2R)和放射4周組(4R)(P=0.000,P=0.000和P=0.000)；放射6周組(6R)的脂肪干細(xì)胞在培養(yǎng)第9天(F=4.696,P=0.018)的增殖速度顯著快于正常組(N)、放射2周組(2R)和放射4周組(4R)(P=0.000,P=0.001和P=0.001)；放射6周組(6R)的脂肪干細(xì)胞在培養(yǎng)第11天(F=23.895,P=0.000)的增殖速度顯著快于正常組(N)、放射2周組(2R)和放射4周組(4R)(P=0.011,P=0.011和P=0.011)(圖2-1.G,表3)。有可能是因?yàn)榉派?周組的細(xì)胞能夠耐受1%胎牛血清的細(xì)胞壓力測(cè)試環(huán)境。 在正常2周組、正常4周組、正常6周組,β-牛乳糖關(guān)聯(lián)的細(xì)胞老化分析的免疫染色陽(yáng)性物質(zhì)較少見(jiàn),但在放射6周組顯得更常見(jiàn)(圖2-1.B)。四組之間(F=49.517,P=0.002),但與正常組相比較,放射6周組的脂肪干細(xì)胞集落形成顯著減少(P=0.013)。而正常組、放射2周組、放射4周組之間無(wú)顯著差異(圖2-1.C,D,表4)。 2、免疫分型 用流式細(xì)胞儀對(duì)放射損傷脂肪干細(xì)胞(r-ADSCs)和正常脂肪干細(xì)胞(n-ADSCs)的免疫分型進(jìn)行分析。結(jié)果顯示放射損傷脂肪干細(xì)胞和正常脂肪干細(xì)胞都表達(dá)CD29和CD90表面抗原,而不表達(dá)造血系和內(nèi)皮系標(biāo)志物即CD31和CD45。 3、細(xì)胞分化能力 用脂肪細(xì)胞分化誘導(dǎo)培養(yǎng)液培養(yǎng)后,正常組脂肪干細(xì)胞被誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞系,在誘導(dǎo)后第14,20天被油紅O染色證實(shí)(圖2-3.D,E)。這個(gè)脂肪細(xì)胞分化現(xiàn)象同樣可見(jiàn)于放射2周組和放射4周組細(xì)胞,但脂肪細(xì)胞分化能力依次減弱。在誘導(dǎo)后第14天,正常組、放射2周組、放射4周組、放射6周組之間脂滴形成無(wú)顯著差異(F=2.950,P=0.222)。在誘導(dǎo)后第20天(F=12.370,P=0.009),放射6周組內(nèi)幾乎看不見(jiàn)脂滴的形成,放射6周組與正常組、放射2周組均有顯著差異(P=0.012,P=0.047)。正常組與放射2周組、放射4周組之間均無(wú)顯著差異(圖2-3.F,表5)。 同樣的,用成骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)液培養(yǎng)后,脂肪干細(xì)胞被誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞,在誘導(dǎo)后第7,14,20天被堿性磷酸酶(AP)(圖2-4.D,E,F)和茜素紅S染色證實(shí)(圖2-4.G.H.I)。作為早期的成骨分化標(biāo)志物,在誘導(dǎo)后第7天所有的組內(nèi)均可見(jiàn)堿性磷酸酶的活性表達(dá)。在誘導(dǎo)后第14天,所有組內(nèi)堿性磷酸酶活性表達(dá)受到抑制,然而此時(shí)在所有組均可觀察到骨樣結(jié)節(jié)(bone-like nodules)的形成。在誘導(dǎo)后第18天,所有組內(nèi)堿性磷酸酶活性表達(dá)增強(qiáng),同時(shí)所有組均形成的骨樣結(jié)節(jié)變得更大,顏色也更深。有趣的是,在放射2周組由對(duì)硝基苯基磷酸酯(pNPP)檢測(cè)的表達(dá)堿性磷酸酶活性的物質(zhì)含量最高,但是正常組、放射2周組、放射4周組、放射6周組四個(gè)組之間無(wú)顯著差異(F=27.247,P=-0.000)(圖2-4.J,表6)。在誘導(dǎo)后7天,所有組均可觀察到由茜素紅S染色顯示的礦物質(zhì)的沉積現(xiàn)象。在第14天和第18天則整體逐漸增強(qiáng)。在誘導(dǎo)后第18天,與AP活性測(cè)定結(jié)果一樣,放射2周組茜素紅S染色在四個(gè)組內(nèi)最為強(qiáng)烈,但各組間無(wú)顯著差異(F=1.594,P=0.247)(圖2-4.K,表7)。另外,在正常組和放射組之間,可以觀察到細(xì)胞集落群的形態(tài)是有所不同的。在正常組,細(xì)胞集落群的分布顯得更均勻。 二、創(chuàng)面愈合 1、創(chuàng)面愈合速度 對(duì)正常組創(chuàng)面來(lái)講,創(chuàng)面的肉芽組織更新鮮,生長(zhǎng)的速度也更快,在創(chuàng)面建立后1周即可見(jiàn)到明顯的創(chuàng)面縮小。但對(duì)于放射組,創(chuàng)面的肉芽組織呈現(xiàn)為灰色,生長(zhǎng)緩慢。與放射后2周組的放射創(chuàng)面相比較,放射后4周組的放射創(chuàng)面形成更明顯的質(zhì)地堅(jiān)硬的痂皮。而放射后6周組的放射創(chuàng)面則更嚴(yán)重。 本實(shí)驗(yàn)中,創(chuàng)面愈合速度的評(píng)定主要是依據(jù)大體標(biāo)本創(chuàng)面的上皮化形成來(lái)進(jìn)行分析。創(chuàng)面建立后每周一次對(duì)創(chuàng)面進(jìn)行數(shù)碼相機(jī)拍照。對(duì)正常組創(chuàng)面來(lái)講,創(chuàng)面的肉芽組織更新鮮,生長(zhǎng)的速度也更快,在創(chuàng)面建立后1周即可見(jiàn)到明顯的創(chuàng)面縮小。但對(duì)于放射組,創(chuàng)面的肉芽組織呈現(xiàn)為灰色,生長(zhǎng)緩慢。與放射后2周組的放射創(chuàng)面相比較,放射后4周組的放射創(chuàng)面形成更明顯的質(zhì)地堅(jiān)硬的痂皮。而放射后6周組的放射創(chuàng)面則更嚴(yán)重。 本實(shí)驗(yàn)中,創(chuàng)面愈合速度的評(píng)定主要是依據(jù)大體標(biāo)本創(chuàng)面的上皮化形成來(lái)進(jìn)行分析。創(chuàng)面建立后每周一次對(duì)創(chuàng)面進(jìn)行數(shù)碼相機(jī)拍照(圖3-2A)。對(duì)于放射后三個(gè)時(shí)間點(diǎn)即放射后2周、放射后4周以及放射后6周分別建立創(chuàng)面對(duì)建立慢性創(chuàng)面的效果評(píng)價(jià),三個(gè)重復(fù)測(cè)量因素分別為：位點(diǎn)group(不接受放射的位點(diǎn)0即正常組創(chuàng)面,放射位點(diǎn)1即未接受脂肪干細(xì)胞注射移植的創(chuàng)面,和放射位點(diǎn)2即接受脂肪干細(xì)胞注射移植的創(chuàng)面)、放射后開(kāi)始造模時(shí)間因素model(放射后2周、放射后4周和放射后6周)、造模后觀測(cè)時(shí)間因素time(創(chuàng)面建立后1周、2周、3周和4周),效應(yīng)中,group*model*time效應(yīng)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.181, P=0.028), group*time效應(yīng)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=25.307, P=0.001), time效應(yīng)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=248.009,P=0.000)其他效應(yīng)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。因此,分別分析不同造模時(shí)間點(diǎn)下的,group和time兩個(gè)重復(fù)測(cè)量因素的方差分析,在造模時(shí)間點(diǎn)為2周和4周,只有時(shí)間效應(yīng)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F時(shí)間=33.250,P時(shí)間=0.008和F時(shí)間=339.381,P時(shí)間=0.000),只針對(duì)時(shí)間因素進(jìn)行單獨(dú)效應(yīng)的分析；在造模時(shí)間點(diǎn)為6周,交互效應(yīng)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F時(shí)間×位點(diǎn)=30.954,P時(shí)間×位點(diǎn)=0.000)。針對(duì)位點(diǎn)和時(shí)間均進(jìn)行單獨(dú)效應(yīng)分析,結(jié)果如表8所示(圖3-2.C,表8)。即是說(shuō)放射2周組內(nèi),未接受脂肪干細(xì)胞移植的放射創(chuàng)面和接受脂肪干細(xì)胞移植的放射創(chuàng)面與正常創(chuàng)面的愈合速度在造模后早期4周內(nèi)無(wú)顯著差異。同樣的,放射4周組內(nèi),未接受脂肪干細(xì)胞移植的放射創(chuàng)面和接受脂肪干細(xì)胞移植的放射創(chuàng)面與正常創(chuàng)面的愈合速度在造模后早期4周內(nèi)也無(wú)顯著差異。但是放射6周組內(nèi),未接受脂肪干細(xì)胞移植的放射創(chuàng)面和接受脂肪干細(xì)胞移植的放射創(chuàng)面與正常創(chuàng)面的愈合速度在造模后第2、3、4周均有顯著差異(F=127.416, P=0.008; F=346.649, P=0.003;和F=70.636,P=0.014)。該統(tǒng)計(jì)結(jié)果提示在造模后放射2周組、放射4周組和放射6周組各組內(nèi)未接受脂肪干細(xì)胞移植的放射組和接受脂肪干細(xì)胞移植的放射組之間創(chuàng)面分別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,從而為后續(xù)的脂肪注射移植建立了良好的創(chuàng)面前提條件。同時(shí),提示了放射2周組、放射4周組和放射6周組的放射創(chuàng)面三組相比較,放射6周組的放射創(chuàng)面更適合于作為慢性創(chuàng)面模型。 對(duì)于自體脂肪干細(xì)胞注射移植對(duì)放射創(chuàng)面的效果評(píng)價(jià)(圖3-2.B,表9),三個(gè)重復(fù)測(cè)量因素分別為：放射開(kāi)始造模時(shí)間因素model(放射后2周、放射后4周和放射后6周)、分組group(未接受脂肪干細(xì)胞移植的放射組和接受脂肪干細(xì)胞移植的放射組)、造模后觀測(cè)時(shí)間因素time(創(chuàng)面建立后第5周、6周、7周、8周和9周),但是由于開(kāi)始造模即放射后4周組,只有一個(gè)實(shí)驗(yàn)對(duì)象(其中一個(gè)對(duì)象由于注射后創(chuàng)面出現(xiàn)不可預(yù)計(jì)情況無(wú)法納入統(tǒng)計(jì)),因此同時(shí)結(jié)合實(shí)際情況和探究目的(關(guān)注分組對(duì)治愈情況的影響),分別分析2周開(kāi)始造模和6周開(kāi)始造模情況下,group和time兩個(gè)重復(fù)測(cè)量因素的方差分析,分組因素均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F分組=1.483,P分組=0.438；F分組=1.114,P分組=0.792),只有time效應(yīng)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F時(shí)間=32.438,P時(shí)間=0.003；F時(shí)間=251.096,P時(shí)間=0.000)。對(duì)于放射2周組,未接受脂肪干細(xì)胞移植的放射組(此處簡(jiǎn)稱放射組)和接受脂肪干細(xì)胞移植的放射組(此處簡(jiǎn)稱移植組),時(shí)間效應(yīng)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F時(shí)間=32.438,P時(shí)間=0.003)。對(duì)于放射6周組,未接受脂肪干細(xì)胞移植的放射組(此處簡(jiǎn)稱放射組)和接受脂肪干細(xì)胞移植的放射組(此處簡(jiǎn)稱移植組),時(shí)間效應(yīng)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F時(shí)間=251.096,P時(shí)間=0.000)。該統(tǒng)計(jì)結(jié)果提示未接受脂肪干細(xì)胞移植的放射組和接受脂肪干細(xì)胞移植的放射組的創(chuàng)面愈合速度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 2、創(chuàng)面組織學(xué)分析 創(chuàng)面建立當(dāng)日,在所有的正常創(chuàng)面和放射創(chuàng)面,沒(méi)有觀察到炎癥反應(yīng)。在創(chuàng)面建立后2周,所有正常組創(chuàng)面可見(jiàn)完整的上皮形成。關(guān)于急性炎癥反應(yīng)和慢性炎癥反應(yīng),放射后4周組和放射后6周組的嚴(yán)重程度明顯比放射后2周組增加。所有的放射組創(chuàng)面上皮化不完全。 在創(chuàng)面建立后4周,所有正常組創(chuàng)面未觀察到急性炎癥反應(yīng)。在所有的放射組創(chuàng)面,急性炎癥反應(yīng)較創(chuàng)面建立后2周時(shí)的情況有所減輕。盡管如此,仍然可以觀察到急性炎癥反應(yīng)。在所有的放射組創(chuàng)面,慢性炎癥反應(yīng)明顯減弱,然而放射后6周組的慢性炎癥反應(yīng)最為明顯。所有的放射組創(chuàng)面上皮化不完全。在創(chuàng)面建立后9周,所有正常組創(chuàng)面未觀察到急性炎癥反應(yīng),仍可見(jiàn)輕度的慢性炎癥反應(yīng)。未接受脂肪干細(xì)胞移植的放射組和接受脂肪干細(xì)胞移植的放射組兩組之間則較為相似,即在所有的放射創(chuàng)面慢性炎癥反應(yīng)明顯減輕。未接受脂肪干細(xì)胞移植的放射組,慢性炎癥反應(yīng)較接受脂肪干細(xì)胞移植的放射組稍嚴(yán)重。但未接受脂肪干細(xì)胞移植的放射組和接受脂肪干細(xì)胞移植的放射組兩組之間病例結(jié)果比較無(wú)顯著性差異。所有組的創(chuàng)面完全上皮化。 結(jié)論 一、我們的結(jié)果顯示在電離輻射誘導(dǎo)的慢性創(chuàng)面中,放射后6周建立創(chuàng)面模型更為合適。本實(shí)驗(yàn)中,與非放射區(qū)域的正常創(chuàng)面在5周完全愈合相比較,所有的放射創(chuàng)面的愈合明顯推遲了大約4周。所有放射組創(chuàng)面的慢性炎癥反應(yīng)比正常創(chuàng)面明顯。這提示劑量為18-Gy單次電離輻射對(duì)創(chuàng)面的愈合有抑制作用,并延遲了創(chuàng)面愈合這一過(guò)程。在創(chuàng)面建立后第4周,干細(xì)胞移植前,放射6周組的創(chuàng)面愈合速度與放射2周組和放射4周組的創(chuàng)面愈合速度相比,比正常組顯著延遲。病理結(jié)果分析證實(shí),在創(chuàng)面建立后第4周,放射6周組的創(chuàng)面慢性炎癥反應(yīng)的程度最嚴(yán)重。 二、既往關(guān)于放射對(duì)干細(xì)胞的影響的研究主要是在體外實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行,或者是研究低劑量的放射所造成的影響,而本實(shí)驗(yàn)中我們小型豬背部接受放射損傷的區(qū)域直接分離培養(yǎng)脂肪源性干細(xì)胞進(jìn)行分析。本實(shí)驗(yàn)研究了18Gy單劑量的電離輻射在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物原位組織損傷進(jìn)程中放射后第2,4,6周分別對(duì)脂肪源性干細(xì)胞所造成的影響。我們的數(shù)據(jù)顯示小型豬皮膚軟組織暴露于18Gy單劑量的電離輻射后,放射損傷脂肪源性干細(xì)胞(r-ADSCs)和正常脂肪源性干細(xì)胞一樣,仍然表達(dá)表面抗原標(biāo)志物即CD29和CD90,而不表達(dá)造血和內(nèi)皮系標(biāo)志物CD31和CD45。與放射2周組和放射4周組相比,放射6周組的脂肪源性干細(xì)胞(r-ADSCs)的增殖能力和脂肪分化能力顯著減弱。我們的數(shù)據(jù)有趣地顯示了在誘導(dǎo)培養(yǎng)14天時(shí),放射2周組放射損傷的脂肪干細(xì)胞的礦物質(zhì)形成能力增強(qiáng),放射6周組放射損傷的脂肪干細(xì)胞的礦物質(zhì)形成能力減弱。然而正常組、放射2周組、放射4周組、放射6周組之間的有堿性磷酸酶活性測(cè)定顯示的成骨分化能力組間在誘導(dǎo)后第7、14、18天均無(wú)顯著差異。在誘導(dǎo)后第18天,正常組、放射2周組、放射4周組、放射6周組之間的由茜素紅S染色顯示的礦物質(zhì)形成能力均無(wú)顯著差異。這也許提示在電離輻射后的早期,活體內(nèi)的脂肪干細(xì)胞的礦物質(zhì)形成能力有短暫性的增強(qiáng)。就本實(shí)驗(yàn)中的慢性創(chuàng)面模型的下一步研究展望是揭示放射誘導(dǎo)損傷的脂肪源性干細(xì)胞的修復(fù)過(guò)程或者是放射損傷對(duì)脂肪源性干細(xì)胞的損傷的持續(xù)性。 三、在術(shù)后即創(chuàng)面建立后4周和6周分別進(jìn)行自體脂肪源性干細(xì)胞注射移植。在創(chuàng)面建立后4周,自體脂肪干細(xì)胞或是單純的細(xì)胞培養(yǎng)液被注射在放射誘導(dǎo)的慢性創(chuàng)面。未接受脂肪干細(xì)胞注射移植的放射創(chuàng)面,其慢性炎癥反應(yīng)比較接受脂肪干細(xì)胞注射移植的放射創(chuàng)面輕度的增加。在創(chuàng)面建立后6周,即第一次脂肪干細(xì)胞注射移植后2周,接受脂肪干細(xì)胞注射移植的放射創(chuàng)面,其創(chuàng)面愈合速度稍快于未接受脂肪干細(xì)胞注射移植的放射創(chuàng)面。然而,接受脂肪干細(xì)胞注射移植的放射創(chuàng)面與未接受脂肪干細(xì)胞注射移植的放射創(chuàng)面兩組之間的創(chuàng)面愈合速度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。接受脂肪干細(xì)胞注射移植的放射創(chuàng)面與未接受脂肪干細(xì)胞注射移植的放射創(chuàng)面兩組之間的組織學(xué)無(wú)明顯差異。未來(lái)將進(jìn)一步研究在慢性創(chuàng)面的治療中怎樣使用自體脂肪干細(xì)胞能達(dá)到更好療效。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R641
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本文編號(hào)：1649221