本文選題：巨細胞病毒　切入點：中樞神經系統(tǒng)　出處：《華中科技大學》2014年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：第一部分 先天性巨細胞病毒中樞神經系統(tǒng)感染對小鼠學習記憶能力的影響 [目的]研究先天性巨細胞病毒中樞神經系統(tǒng)感染對小鼠學習記憶能力的影響。 [方法]①建立小鼠巨細胞病毒(murine cytomegalovirus, MCMV)中樞神經系統(tǒng)感染模型：用ELISA法篩選無感染史的SPF級BALB/c小鼠(H-2d),適應性飼養(yǎng)一周,按雌雄比例2：1合籠受孕,受孕母鼠單獨飼養(yǎng)。仔鼠出生當天,隨機分為實驗組(7只)和對照組(7只),實驗組在出生當日通過顱內注射接種MCMV Smith株病毒懸液(TCID50=10-5)1.75μl,對照組按相同方法接種病毒溶媒(含3%胎牛血清DMEM)1.75μl；②于30日齡應用物體識別實驗檢測兩組小鼠對新物體探索時間和分辨指數(shù)；③在完成物體識別實驗后3日,應用Morris水迷宮實驗觀察倆組小鼠游泳軌跡、游出距離和游泳潛伏期。 [結果]與對照組相比,①實驗組新物體探索時間降低,分辨指數(shù)下降,差異均具有顯著性(P0.05)；②與在訓練后第3、4、5天逃生游泳軌跡長度明顯增加,游出距離增加,游泳潛伏期延長,差異均具有顯著性(P0.05)。 [結論]先天性MCMV中樞神經系統(tǒng)感染能導致小鼠學習記憶能力下降。 第二部分 先天性MCMV中樞神經系統(tǒng)感染對小鼠海馬突觸可塑性的影響 [目的]觀察先天性MCMV中樞神經系統(tǒng)感染對小鼠海馬突觸可塑性的影響,探究MCMV感染導致認知能力下降的電生理機制。 [方法]①建立先天性MCMV中樞神經系統(tǒng)感染動物模型(同第一部分)。②制備小鼠海馬腦片：取30日齡實驗組和對照組小鼠各5只,乙醚麻醉后被迅速斷頭并快速取出其腦組織浸泡于通氧的預冷腦脊液中。用刀片切除部分無關的腦組織,暴露海馬區(qū),然后固定于切片機的載物臺上。將502膠水均勻涂于切片機載物臺上,并將腦組織牢固粘在載物臺上。切取小鼠海馬腦片,厚度400μm。將切好的腦片轉移到孵育槽中孵育至少1.5小時,充分恢復腦片。③采用腦片膜片鉗技術檢測各組海馬腦片海馬場興奮性突觸后電位(field excitatory postsynaptic potential, fEPSP)、長時程增強(long-term potentiation, LTP)、雙脈沖易化(paired-pulse facilication, PPF)、海馬CA1區(qū)錐體神經元微小興奮性突觸后電流(miniature excitatory post synaptic currents, mEPSCs)累計電流及釋放頻率、海馬CA1區(qū)NMDA受體及AMPA受體介導的興奮性突觸后電流(excitatory post synaptic currents, EPSCs)。 [結果]①與對照組(n=11,來源于5只小鼠)相比,給予HFS刺激后實驗組(n=9,來源于5只小鼠)海馬腦片CA3-CA1區(qū)典型的fEPSP降低,60分鐘內LTP水平明顯下降,差異極具顯著性(P0.01)；②在給予HFS刺激之前,兩組海馬CA3-CA1區(qū)PPF反應過程在選取的4個點中差異均不具有顯著性；在HFS刺激之前,在相同刺激強度下兩組海馬CA3-CA1區(qū)產生的fEPSP差異不具有顯著性。③實驗組(n=7,來源于5只小鼠)與對照組(n=6,來源于5只小鼠)相比,海馬CA1區(qū)錐體神經元mEPSCs累計電流明顯減少(P0.01),但其累積釋放頻率無明顯差異(P0.05)。④實驗組由NMDA受體途徑介導的EPSCs電流振幅(27.6±2.3pA,n=7,來源于5只小鼠)顯著低于對照組(53±4.8pA,n=11,來源于5只小鼠),差異極具顯著性(P0.01)。⑤實驗組由AMPA受體途徑介導的EPSCs電流振幅(45.8±10pA,n=6)低于對照組(59.94-4.3pA,n=11,來源于5只小鼠),差異具有顯著性(P0.05)。⑥實驗組中由NMDA受體介導的EPSC振幅與AMPA介導的EPSC振幅比率(0.42±0.03,n=7,來源于5只小鼠)顯著低于對照組(0.66±0.02,n=7,來源于5只小鼠),(P0.01)。 [結論]①MCMV先天性中樞神經系統(tǒng)感染能顯著抑制海馬CA3-CA1區(qū)信號傳導通路的LTP,但不影響該區(qū)基礎性突觸傳遞。②CMV先天性中樞神經系統(tǒng)感染主要通過突觸后機制影響CA3-CA1區(qū)信號傳遞,突觸前遞質釋放功能無明顯改變。③MCMV感染能顯著降低海馬CA1區(qū)NMDA受體和AMPA受體介導的EPSCs,其中對NMDA受體介導的EPSCs影響更加明顯。總結：MCMV感染顯著抑制海馬神經元突觸的LTP,其致病機理主要是通過損傷突觸后機制的NMDA受體和AMPA受體途徑的突觸可塑性,對突觸前機制的影響并不明顯。 第三部分 先天性MCMV中樞神經系統(tǒng)感染對小鼠海馬突觸后機制相關蛋白合成與分泌的影響 [目的]研究先天性MCMV中樞神經系統(tǒng)感染對乳鼠海馬突觸后機制相關蛋白NR1、NR2A、NR2B、GluR1、GluR2合成及分泌的影響。 [方法]①建立先天性MCMV中樞神經系統(tǒng)感染模型(同第一部分),無菌收集完成Morris水迷宮實驗后的小鼠腦組織,在解剖顯微鏡下分離出海馬組織。②應用Real-time PCR及Western Blot技術檢測各組海馬突觸后機制相關蛋白NR1、NR2A、 NR2B、GluR1、GluR2的編碼基因轉錄水平及蛋白質表達水平。 [結果]與對照組(n=7)相比,實驗組(n=7)海馬NMDA受體亞基NR2A編碼基因轉錄水平及蛋白質表達水平無明顯改變；NMDA受體亞基NR1、AMPA受體亞基GluR1、GluR2編碼基因轉錄水平及蛋白質表達水平均降低,差異具有顯著性(P0.05); NMDA受體亞基NR2B編碼基因轉錄水平及蛋白質表達水平顯著降低(P0.01)。 [結論]先天性MCMV神經系統(tǒng)感染可降低小鼠海馬NMDA受體亞基NR1、NR2B和AMPA受體亞基GluR1、GluR2編碼基因轉錄水平及蛋白質表達水平。這可能是先天性MCMV神經系統(tǒng)感染導致學習記憶等認知功能障礙的發(fā)病機制。 第四部分 先天性MCMV中樞神經系統(tǒng)感染對小鼠海馬膽固醇表達的影響 [目的]研究先天性MCMV中樞神經系統(tǒng)感染對小鼠海馬膽固醇近期和中遠期代謝水平的影響。 [方法]①建立先天性MCMV中樞神經系統(tǒng)感染模型(同第一部分),于3d、15d、30d快速活殺斷頭,無菌收集腦組織,在解剖顯微鏡下分離出海馬(收集兩組小鼠3d、15d、30d海馬組織各7個)。②將海馬組織放入勻漿器,按1ml/100mg加入色譜純無水乙醇于冰上磨成勻漿；在15000r/min,4℃離心2次,每次20min。取上清液在0.45μm濾器中過濾2次,將濾液分裝,-70℃保持,待測。③應用高效液相色譜技術(High-performance liquid chomatography,HPLC)檢測各組海馬膽固醇的表達水平。 [結果]①在選擇的色譜條件下,膽固醇的保留時間為8.7min,膽固醇標準曲線線性關系良好,線性回歸方程為：Y=4422624X+7835,R2=0.99969,最低檢測限為0.03mg/ml。②儀器精密度實驗變異系數(shù)為0.98%,儀器精密度良好；加樣回收率實驗證明平均回收率為99.12%。③對照組及實驗組不同發(fā)育時期海馬膽固醇表達水平：對照組3d,15d,30d海馬膽固醇含量分別為：4.55±0.38mg/g,7.80±0.55mg/g,12.27±0.50mg/g；實驗組其數(shù)值分別為：3.49±0.51mg/g,5.57±0.45mg/g,8.37±0.48mg/g。 [結論]①HPLC檢測小鼠海馬膽固醇具有最低檢測限低、精密度高、回收率高、方便快捷等特點,我們的檢測條件可為臨床及基礎研究者提供參考。②小鼠海馬神經發(fā)育過程膽固醇表達水平漸進性升高,先天性MCMV中樞神經系統(tǒng)感染能在近期和中遠期降低膽固醇表達水平。⑨CMV中樞神經系統(tǒng)感染干預海馬膽固醇代謝,降低膽固醇表達水平,抑制神經元突觸形成、發(fā)育及成熟可能是其導致學習記憶等認知功能障礙的另一個重要原因。
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【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R714.251

【參考文獻】

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1 譚來勛,孫圣剛,王細林,李效寬,梅之南,張雙國;高效液相色譜法測定大鼠海馬膽固醇[J];第四軍醫(yī)大學學報;2005年19期

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本文編號：1638250