本文選題：巨細(xì)胞病毒　切入點(diǎn)：中樞神經(jīng)系統(tǒng)　出處：《華中科技大學(xué)》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：第一部分 先天性巨細(xì)胞病毒中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染對小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響 [目的]研究先天性巨細(xì)胞病毒中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染對小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響。 [方法]①建立小鼠巨細(xì)胞病毒(murine cytomegalovirus, MCMV)中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染模型：用ELISA法篩選無感染史的SPF級BALB/c小鼠(H-2d),適應(yīng)性飼養(yǎng)一周,按雌雄比例2：1合籠受孕,受孕母鼠單獨(dú)飼養(yǎng)。仔鼠出生當(dāng)天,隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(7只)和對照組(7只),實(shí)驗(yàn)組在出生當(dāng)日通過顱內(nèi)注射接種MCMV Smith株病毒懸液(TCID50=10-5)1.75μl,對照組按相同方法接種病毒溶媒(含3%胎牛血清DMEM)1.75μl；②于30日齡應(yīng)用物體識別實(shí)驗(yàn)檢測兩組小鼠對新物體探索時(shí)間和分辨指數(shù)；③在完成物體識別實(shí)驗(yàn)后3日,應(yīng)用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)觀察倆組小鼠游泳軌跡、游出距離和游泳潛伏期。 [結(jié)果]與對照組相比,①實(shí)驗(yàn)組新物體探索時(shí)間降低,分辨指數(shù)下降,差異均具有顯著性(P0.05)；②與在訓(xùn)練后第3、4、5天逃生游泳軌跡長度明顯增加,游出距離增加,游泳潛伏期延長,差異均具有顯著性(P0.05)。 [結(jié)論]先天性MCMV中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染能導(dǎo)致小鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降。 第二部分 先天性MCMV中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染對小鼠海馬突觸可塑性的影響 [目的]觀察先天性MCMV中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染對小鼠海馬突觸可塑性的影響,探究MCMV感染導(dǎo)致認(rèn)知能力下降的電生理機(jī)制。 [方法]①建立先天性MCMV中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染動物模型(同第一部分)。②制備小鼠海馬腦片：取30日齡實(shí)驗(yàn)組和對照組小鼠各5只,乙醚麻醉后被迅速斷頭并快速取出其腦組織浸泡于通氧的預(yù)冷腦脊液中。用刀片切除部分無關(guān)的腦組織,暴露海馬區(qū),然后固定于切片機(jī)的載物臺上。將502膠水均勻涂于切片機(jī)載物臺上,并將腦組織牢固粘在載物臺上。切取小鼠海馬腦片,厚度400μm。將切好的腦片轉(zhuǎn)移到孵育槽中孵育至少1.5小時(shí),充分恢復(fù)腦片。③采用腦片膜片鉗技術(shù)檢測各組海馬腦片海馬場興奮性突觸后電位(field excitatory postsynaptic potential, fEPSP)、長時(shí)程增強(qiáng)(long-term potentiation, LTP)、雙脈沖易化(paired-pulse facilication, PPF)、海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元微小興奮性突觸后電流(miniature excitatory post synaptic currents, mEPSCs)累計(jì)電流及釋放頻率、海馬CA1區(qū)NMDA受體及AMPA受體介導(dǎo)的興奮性突觸后電流(excitatory post synaptic currents, EPSCs)。 [結(jié)果]①與對照組(n=11,來源于5只小鼠)相比,給予HFS刺激后實(shí)驗(yàn)組(n=9,來源于5只小鼠)海馬腦片CA3-CA1區(qū)典型的fEPSP降低,60分鐘內(nèi)LTP水平明顯下降,差異極具顯著性(P0.01)；②在給予HFS刺激之前,兩組海馬CA3-CA1區(qū)PPF反應(yīng)過程在選取的4個(gè)點(diǎn)中差異均不具有顯著性；在HFS刺激之前,在相同刺激強(qiáng)度下兩組海馬CA3-CA1區(qū)產(chǎn)生的fEPSP差異不具有顯著性。③實(shí)驗(yàn)組(n=7,來源于5只小鼠)與對照組(n=6,來源于5只小鼠)相比,海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元mEPSCs累計(jì)電流明顯減少(P0.01),但其累積釋放頻率無明顯差異(P0.05)。④實(shí)驗(yàn)組由NMDA受體途徑介導(dǎo)的EPSCs電流振幅(27.6±2.3pA,n=7,來源于5只小鼠)顯著低于對照組(53±4.8pA,n=11,來源于5只小鼠),差異極具顯著性(P0.01)。⑤實(shí)驗(yàn)組由AMPA受體途徑介導(dǎo)的EPSCs電流振幅(45.8±10pA,n=6)低于對照組(59.94-4.3pA,n=11,來源于5只小鼠),差異具有顯著性(P0.05)。⑥實(shí)驗(yàn)組中由NMDA受體介導(dǎo)的EPSC振幅與AMPA介導(dǎo)的EPSC振幅比率(0.42±0.03,n=7,來源于5只小鼠)顯著低于對照組(0.66±0.02,n=7,來源于5只小鼠),(P0.01)。 [結(jié)論]①M(fèi)CMV先天性中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染能顯著抑制海馬CA3-CA1區(qū)信號傳導(dǎo)通路的LTP,但不影響該區(qū)基礎(chǔ)性突觸傳遞。②CMV先天性中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染主要通過突觸后機(jī)制影響CA3-CA1區(qū)信號傳遞,突觸前遞質(zhì)釋放功能無明顯改變。③MCMV感染能顯著降低海馬CA1區(qū)NMDA受體和AMPA受體介導(dǎo)的EPSCs,其中對NMDA受體介導(dǎo)的EPSCs影響更加明顯。總結(jié)：MCMV感染顯著抑制海馬神經(jīng)元突觸的LTP,其致病機(jī)理主要是通過損傷突觸后機(jī)制的NMDA受體和AMPA受體途徑的突觸可塑性,對突觸前機(jī)制的影響并不明顯。 第三部分 先天性MCMV中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染對小鼠海馬突觸后機(jī)制相關(guān)蛋白合成與分泌的影響 [目的]研究先天性MCMV中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染對乳鼠海馬突觸后機(jī)制相關(guān)蛋白NR1、NR2A、NR2B、GluR1、GluR2合成及分泌的影響。 [方法]①建立先天性MCMV中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染模型(同第一部分),無菌收集完成Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)后的小鼠腦組織,在解剖顯微鏡下分離出海馬組織。②應(yīng)用Real-time PCR及Western Blot技術(shù)檢測各組海馬突觸后機(jī)制相關(guān)蛋白NR1、NR2A、 NR2B、GluR1、GluR2的編碼基因轉(zhuǎn)錄水平及蛋白質(zhì)表達(dá)水平。 [結(jié)果]與對照組(n=7)相比,實(shí)驗(yàn)組(n=7)海馬NMDA受體亞基NR2A編碼基因轉(zhuǎn)錄水平及蛋白質(zhì)表達(dá)水平無明顯改變；NMDA受體亞基NR1、AMPA受體亞基GluR1、GluR2編碼基因轉(zhuǎn)錄水平及蛋白質(zhì)表達(dá)水平均降低,差異具有顯著性(P0.05); NMDA受體亞基NR2B編碼基因轉(zhuǎn)錄水平及蛋白質(zhì)表達(dá)水平顯著降低(P0.01)。 [結(jié)論]先天性MCMV神經(jīng)系統(tǒng)感染可降低小鼠海馬NMDA受體亞基NR1、NR2B和AMPA受體亞基GluR1、GluR2編碼基因轉(zhuǎn)錄水平及蛋白質(zhì)表達(dá)水平。這可能是先天性MCMV神經(jīng)系統(tǒng)感染導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知功能障礙的發(fā)病機(jī)制。 第四部分 先天性MCMV中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染對小鼠海馬膽固醇表達(dá)的影響 [目的]研究先天性MCMV中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染對小鼠海馬膽固醇近期和中遠(yuǎn)期代謝水平的影響。 [方法]①建立先天性MCMV中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染模型(同第一部分),于3d、15d、30d快速活殺斷頭,無菌收集腦組織,在解剖顯微鏡下分離出海馬(收集兩組小鼠3d、15d、30d海馬組織各7個(gè))。②將海馬組織放入勻漿器,按1ml/100mg加入色譜純無水乙醇于冰上磨成勻漿；在15000r/min,4℃離心2次,每次20min。取上清液在0.45μm濾器中過濾2次,將濾液分裝,-70℃保持,待測。③應(yīng)用高效液相色譜技術(shù)(High-performance liquid chomatography,HPLC)檢測各組海馬膽固醇的表達(dá)水平。 [結(jié)果]①在選擇的色譜條件下,膽固醇的保留時(shí)間為8.7min,膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好,線性回歸方程為：Y=4422624X+7835,R2=0.99969,最低檢測限為0.03mg/ml。②儀器精密度實(shí)驗(yàn)變異系數(shù)為0.98%,儀器精密度良好；加樣回收率實(shí)驗(yàn)證明平均回收率為99.12%。③對照組及實(shí)驗(yàn)組不同發(fā)育時(shí)期海馬膽固醇表達(dá)水平：對照組3d,15d,30d海馬膽固醇含量分別為：4.55±0.38mg/g,7.80±0.55mg/g,12.27±0.50mg/g；實(shí)驗(yàn)組其數(shù)值分別為：3.49±0.51mg/g,5.57±0.45mg/g,8.37±0.48mg/g。 [結(jié)論]①HPLC檢測小鼠海馬膽固醇具有最低檢測限低、精密度高、回收率高、方便快捷等特點(diǎn),我們的檢測條件可為臨床及基礎(chǔ)研究者提供參考。②小鼠海馬神經(jīng)發(fā)育過程膽固醇表達(dá)水平漸進(jìn)性升高,先天性MCMV中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染能在近期和中遠(yuǎn)期降低膽固醇表達(dá)水平。⑨CMV中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染干預(yù)海馬膽固醇代謝,降低膽固醇表達(dá)水平,抑制神經(jīng)元突觸形成、發(fā)育及成熟可能是其導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知功能障礙的另一個(gè)重要原因。
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【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R714.251

【參考文獻(xiàn)】

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1 譚來勛,孫圣剛,王細(xì)林,李效寬,梅之南,張雙國;高效液相色譜法測定大鼠海馬膽固醇[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2005年19期

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本文編號：1638250