發(fā)布時(shí)間：2018-03-17 08:55

  本文選題：非酒精性脂肪性肝病　切入點(diǎn)：動(dòng)物模型　出處：《安徽醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：第一部分MCD+HF誘導(dǎo)S-D大鼠脂肪肝模型的研究[目的]科學(xué)家們長(zhǎng)期致力于建立的脂肪肝動(dòng)物模型,以期能夠更加準(zhǔn)確的模擬NAFLD的發(fā)病機(jī)理和進(jìn)展過(guò)程,以此來(lái)探索新的治療策略。然而,到目前為止,尚沒(méi)有一種模型能夠完全準(zhǔn)確地模擬出NAFLD全部特點(diǎn)。在營(yíng)養(yǎng)型脂肪肝模型中最常用的飼料是蛋氨酸-膽堿缺乏(methionine-choline deficiency,MCD)飼料喂養(yǎng)的模型和高脂肪(high fat,HF)喂養(yǎng)模型。前者主要缺陷是動(dòng)物不僅不會(huì)出現(xiàn)體重增加,反而表現(xiàn)為體重嚴(yán)重下降,后者存在誘導(dǎo)結(jié)果不穩(wěn)定性。因此,本實(shí)驗(yàn)擬采用混合型營(yíng)養(yǎng)性(MCD+HF)大鼠模型建立不同程度脂肪肝模型,確定其穩(wěn)定性和適用性,以適用于本實(shí)驗(yàn)下一步研究。[方法]用正常大鼠飼料和MCD+HF復(fù)合型飼料2種不同飼料喂食Sprague-Dawley(S-D)大鼠誘導(dǎo)肝臟脂肪變性,分別為正常對(duì)照組和NAFLD組。S-D大鼠用正常飼料喂養(yǎng)直至體重達(dá)到250-320g,然后進(jìn)入實(shí)驗(yàn),每組6只大鼠,分別用正常飼料和MCD+HF分別1,2,4,6周和3個(gè)月。每天記錄下大鼠體重。在喂養(yǎng)終點(diǎn),大鼠被麻醉后開(kāi)腹后,收集肝臟標(biāo)本用于分子生物學(xué)檢測(cè),并收集血液做生化分析。肝臟脂肪變性從三個(gè)方面來(lái)評(píng)估:(1)肝臟脂肪變性程度:大體肉眼描述性定性評(píng)估,肝臟-體重比,組織學(xué)對(duì)肝臟中脂肪蓄積分布的評(píng)估;(2)肝臟損傷程度,用組織學(xué)標(biāo)準(zhǔn)定性評(píng)估肝臟損傷,測(cè)量肝酶水平來(lái)定量分析肝臟損傷情況;(3)肝臟代謝功能:通過(guò)評(píng)估LPO和肝臟GSH來(lái)評(píng)價(jià)肝臟代謝障礙,定量分析LPO和肝總GSH是反映氧應(yīng)激和抗氧化能力的指標(biāo)。[結(jié)果]所有進(jìn)入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均存活。NAFLD組中使用MCD+HF飼養(yǎng)沒(méi)有影響到大鼠的正常生長(zhǎng)和壽命。3個(gè)月喂養(yǎng)后,兩組大鼠的體重增加到400-450g,體重增加明顯,結(jié)果兩組數(shù)據(jù)無(wú)差異。1-2周后,NAFLD組的肝臟與對(duì)照組相比出現(xiàn)增大,脂肪增多,肝臟表面變黃。肝臟邊緣變圓鈍,肝臟質(zhì)地開(kāi)始出現(xiàn)輕度柔軟感。大約在4-6周時(shí),肉眼觀表現(xiàn)更加明顯,之后出現(xiàn)輕度的好轉(zhuǎn)。NAFLD組絕對(duì)肝切除量在第4,6周和3個(gè)月時(shí),明顯重于對(duì)照組(13.80±1.79 vs 8.76±0.92,14.20±1.15vs 8.75±0.91,12.56±1.03 vs 8.78±0.82,p0.05,單位g)。而各時(shí)間段的肝-體重比,NAFLD組均明顯高于對(duì)照組(4.05±0.35 vs 3.22±0.21,4.51±0.27 vs 3.22±0.22,5.42±0.74 vs 3.23±0.21,5.52±0.26 vs 3.22±0.20,4.48±0.30 vs 3.24±0.19,p0.05,單位g)。在NAFLD組,第1周喂養(yǎng)時(shí),肝細(xì)胞出現(xiàn)輕度到中度小泡型脂肪變和輕度的大泡型脂肪變,其程度越15%左右,為輕度肝脂肪變性。小泡型脂肪變主要出現(xiàn)在中央周圍區(qū)(1區(qū))和3區(qū),而混合型脂肪變主要出現(xiàn)在2區(qū)。喂養(yǎng)2周后,肝臟出現(xiàn)中等混合型空泡脂肪變,脂肪變性程度約32%,呈中度肝脂肪變性。大泡型脂肪變主要分布在1和2區(qū),小泡型脂肪變主要分布在3區(qū),混合型空泡脂肪變主要分布在1和2區(qū)。在4周末,肝臟出現(xiàn)嚴(yán)重混合型脂肪變,脂肪變性程度約占63%,為重度肝脂肪變性。大泡型脂肪變主要分布在1和2區(qū),而小泡型分布在3區(qū)。在第6周末,肝臟脂肪變類型與分布與4周時(shí)觀察基本一致。但是脂肪變嚴(yán)重程度有所減輕。在3個(gè)月末,以重度肝脂肪變性為表現(xiàn),主要是以1區(qū)和2區(qū)大泡型空泡變,和3區(qū)混合型空泡樣變性。NAFLD組大鼠出現(xiàn)輕度的肝損害表現(xiàn),主要是肝酶的釋放。在喂養(yǎng)1-2周時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)轉(zhuǎn)氨酶的升高,4周時(shí)達(dá)到最高值,主要是以AST升高明顯。ALT在所有觀察點(diǎn)均數(shù)沒(méi)有超過(guò)100IU/L,在第6周時(shí)比對(duì)照組有明顯增高(89.50±29.83 vs 42.50±5.51,p0.05,單位IU/L)。NAFLD組釋放AST水平在第4,6周和第3月時(shí)明顯高于對(duì)照組(210.17±95.28 vs92.03±23.70,199.67±54.06 vs 90.03±21.70,140.01±22.73 vs 90.03±21.70,p0.05,單位IU/L)并且與隨肝脂肪變性嚴(yán)重程度改變而改變。NAFLD組大鼠肝臟組織發(fā)現(xiàn)了LPO的升高(68.7±14.0 vs 53.2±2.8,120.6±18.3 v 53.1±2.7,150.3±43.0 vs53.3±2.5,168.7±44.5 vs 52.8±3.0,148.1±26.7 vs 53.3±2.7,p0.05,單位μg/g)。NAFLD組誘導(dǎo)出GSH的下降,從第一周飼養(yǎng)開(kāi)始,GSH值就開(kāi)始下降到,在3個(gè)月末期,GSH有輕度上升(2476.4±67.7 vs 3698.3±122.8,2371.8±127.3 vs3720.2±117.5,2237.9±118.1 vs 3710.7±102.8,2399.1±60.8 vs 3701.4±98.8,2426.6±113.5 vs 3710.2±103.4,p0.05,單位μg/g)。[結(jié)論]MCD+HF飼料能誘導(dǎo)S-D大鼠肝脂肪變性。在整個(gè)飼養(yǎng)過(guò)程中,無(wú)一死亡動(dòng)物,具有良好的動(dòng)物耐受性。MCD+HF該種飼養(yǎng)方法能誘導(dǎo)出S-D大鼠輕、中、重度脂肪肝模型,并且方法可靠,穩(wěn)定。該模型符合有關(guān)脂肪肝對(duì)缺血再灌注損傷相關(guān)研究的要求,根據(jù)研究需要選擇MCD+HF飼養(yǎng)2~4周的大鼠。第二部分鋰鹽對(duì)大鼠肝臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[目的]已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于治療精神疾病精神類藥物--鋰鹽,被證實(shí)在很多器官缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用。本部分研究為解決鋰鹽在正常肝臟IRI中的作用機(jī)制如何,以為下一部分脂肪肝IRI研究打下基礎(chǔ)。[方法]S-D大鼠用正常飼料喂養(yǎng)直至標(biāo)準(zhǔn)體重,然后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。在喂養(yǎng)期的最后3天,實(shí)驗(yàn)組給于鋰劑,對(duì)照組給于生理鹽水,鋰鹽組在IRI后2天內(nèi)每天再次給藥。之后給予手術(shù)加以60min選擇性熱缺血處理。再灌注后0.5h,6h,24h,48h分別處死。切取左外葉和右葉作為組織學(xué)分析。收集右中葉和血清做分子生物學(xué)分析。本實(shí)驗(yàn)切片復(fù)水后用ASDCL染色來(lái)研究肝再灌注后中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野(HPF,400×)采用手動(dòng)計(jì)數(shù)ASDCL陽(yáng)性中性粒細(xì)胞。HMGB1免疫組化和ELISA法了解HMGB1在肝IRI是否存在移位現(xiàn)象以及血清中HMGB1含量。蛋白免疫印跡檢測(cè)再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)的GSK3β,p-GSK3βSer9,ERK,p-ERK,p38,p-p38,JNK,p-JNK,caspase-3,LC3,p-62的表達(dá)變化。分析鋰鹽是否影響炎癥反應(yīng),自噬水平以及GSK3β和MAPK信號(hào)途徑。[結(jié)果]本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)鋰鹽組再灌注后的0.5h,6h,24h,48h組與生理鹽水組的肝酶學(xué)變化。經(jīng)過(guò)60分鐘熱缺血處理后,血清ALT水平在再灌注后0.5h出現(xiàn)升高,6h后達(dá)到高峰,之后開(kāi)始下降。而鋰鹽處理組在再灌注后對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)明顯下降(ALT釋放水平分別為596±171 vs 392±126,823±155 vs 604±119,221±34 vs147±34,73±5 vs 62±9,各組p0.05,單位IU/L;AST釋放水平為574±140 vs371±101,892±160 vs 594±127,426±35 vs 363±45,110±20 vs 98±11,各組p0.05,單位IU/L)。ASDCL染色陽(yáng)性細(xì)胞結(jié)果顯示鋰鹽處理組中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)明顯要低于生理鹽水組大鼠,鋰鹽處理組:9±1/HPF;生理鹽水組:14±4/HPF,p0.05。肝臟IR后,HMGB1表達(dá)上調(diào),并且從細(xì)胞核外移到細(xì)胞漿中。本實(shí)驗(yàn)采用ELISA方法檢測(cè)肝缺血再灌注后HMGB1表達(dá),在生理鹽水組合鋰鹽處理組中均有HMGB1表達(dá)升高,而鋰鹽處理組的HMGB1明顯低于生理鹽水組,在0.5h組內(nèi)生理鹽水組HMGB1高于鋰鹽組約3倍。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)60分鐘熱缺血再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)了解缺血再灌注有GSK3β磷酸化水平。與正常未處理組比較,再灌注后0.5h磷酸化的GSK3β/Ser9水平快速下降,并保持去磷酸化狀態(tài)。而鋰鹽處理組的磷酸化GSK3β/Ser9水平高于生理鹽水組大鼠。鋰鹽處理組并不影響細(xì)胞內(nèi)總GSK3β水平。本實(shí)驗(yàn)為了解鋰鹽是否能影響肝缺血再灌注后MAPK激活,檢測(cè)了ERK,JNK與p38的磷酸化水平。結(jié)果顯示在生理鹽水組再灌注后0.5h,ERK,JNK和p38磷酸化增加。而鋰鹽處理組在再灌注后0.5h,ERK磷酸化水平高于生理鹽水組。JNK和p38磷酸化水平是下降的。鋰鹽處理組并沒(méi)有影響到整個(gè)細(xì)胞水平的ERK,JNK和p38表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究凋亡蛋白caspase-3表達(dá)了解鋰鹽在缺血再灌注損傷中對(duì)凋亡的影響。相對(duì)于生理鹽水組,鋰鹽處理組的大鼠熱缺血再灌注后caspase-3分裂在0.5h,6h時(shí)被抑制。本實(shí)驗(yàn)為證明鋰鹽是否能誘導(dǎo)肝臟IRI肝細(xì)胞自噬,檢測(cè)自噬蛋白LC3和p62在鋰鹽處理組和生理鹽水處理組表達(dá)水平。在熱缺血60分鐘后,LC3-II表達(dá)在整個(gè)再灌注過(guò)程中升高,在鋰鹽處理組中LC3-II表達(dá)明顯升高。而p62表達(dá)在再灌注后各個(gè)時(shí)間段均有明顯下降,且鋰鹽處理組要低于生理鹽水組。[結(jié)論]鋰鹽具有保護(hù)肝IRI的作用。鋰鹽保護(hù)肝IRI作用機(jī)制可能包括抑制炎癥反應(yīng),抑制GSK3β活性,調(diào)控MAPK活性,抑制肝細(xì)胞凋亡,以及誘導(dǎo)肝細(xì)胞自噬。第三部分鋰鹽對(duì)大鼠脂肪肝缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制研究[目的]本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立脂肪肝動(dòng)物模型來(lái)研究鋰鹽在肝臟缺血再灌注損傷中作用及其分子機(jī)制,為臨床降低NAFLD患者行肝臟手術(shù)損傷提供理論基礎(chǔ)。[方法]標(biāo)準(zhǔn)體重S-D大鼠用MCD+HF飼料喂養(yǎng)2周,建立中度脂肪肝模型。在行手術(shù)前3天,實(shí)驗(yàn)組給于鋰劑,對(duì)照組給于生理鹽水。之后給予手術(shù)加以60min選擇性熱缺血處理。再灌注后0.5h,6h,24h,48h分別處死。切取左外葉和右上葉做組織學(xué)分析,收集右中葉和血清做分子生物學(xué)分析。本實(shí)驗(yàn)用水化切片ASDCL染色來(lái)研究肝再灌注后中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野(HPF,400×)采用手動(dòng)計(jì)數(shù)ASDCL陽(yáng)性中性粒細(xì)胞。HMGB1免疫組化了解HMGB1在肝IRI是否存在移位現(xiàn)象,用ELISA方法檢測(cè)血清HMGB1含量。蛋白免疫印跡檢測(cè)再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)的GSK3β,p-GSK3βSer9,ERK,p-ERK,JNK,p-JNK,caspase-3,LC3,p-62的表達(dá)變化。分析鋰鹽是否影響脂肪肝IRI的炎癥反應(yīng),自噬水平以及GSK3β和MAPK信號(hào)途徑。[結(jié)果]S-D大鼠用MCD+HF喂養(yǎng)2周后表現(xiàn)為中度肝臟脂肪變性。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)鋰鹽組再灌注后的0.5h,6h,24h,48h組與生理鹽水組的肝酶學(xué)變化,證明鋰鹽有降低脂肪肝臟ALT,AST釋放水平作用。經(jīng)過(guò)60分鐘熱缺血處理后,血清ALT和AST顯著升高。二者均再灌注后0.5h血清ALT升高,6h后達(dá)到峰值,之后下降。鋰鹽明顯減輕IRI肝損傷作用,表現(xiàn)為血清中ALT和AST水平相對(duì)更低(ALT釋放水平402±120 vs 616±171,p0.05;450±102 vs 860±134,p0.05;310±52 vs 402±44,p0.05;198±34 vs 210±35,p0.05;AST釋放水平391±127 vs598±139,p0.05;657±178 vs 1123±234,p0.05;610±56 vs 178±18,p0.05;788±98 vs 245±36,p0.05;單位:IU/L)。S-D大鼠喂養(yǎng)MCD+HF飼料2W后檢查肝臟自噬蛋白表達(dá)。自噬蛋白LC3-II的表達(dá)在脂肪肝細(xì)胞中顯著降低,而自噬蛋白p62的表達(dá)在脂肪肝細(xì)胞中顯著增加。而經(jīng)過(guò)60分鐘熱缺血脂肪肝大鼠LC3-II表達(dá)水平,在各個(gè)時(shí)間段顯示鋰鹽處理組表達(dá)水平明顯升高,且與生理鹽水組比較有明顯升高,同時(shí)鋰鹽組相對(duì)于生理鹽水組顯著降低了p62的蛋白表達(dá)水平。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在再灌注后0.5h GSK3β/Ser9磷酸化水平迅速升高,隨著6h后輕度降低后再次升高,在24小時(shí)后達(dá)到峰值。與生理鹽水組水平相比,鋰鹽預(yù)處理組的GSK3β/Ser9磷酸化水平更高一些,而細(xì)胞總GSK3β水平?jīng)]有受到鋰鹽影響。而再灌注后0.5h生理鹽水組中脂肪肝細(xì)胞核內(nèi)HMGB1染色明顯減少,免疫組化結(jié)果顯示HMGB1陰性核率:鋰鹽處理組3.42±1.04%,而生理鹽水組為6.18±1.21%,p0.01。本實(shí)驗(yàn)采用ELISA方法檢測(cè)肝缺血再灌注后HMGB1表達(dá),在生理鹽水組合鋰鹽處理組中均有HMGB1表達(dá)升高,而0.5h,6h組鋰鹽處理組的HMGB1顯著低于生理鹽水組。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)ASDCL印跡陽(yáng)性中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)在熱缺血60min再灌注24小時(shí)后脂肪肝大鼠肝臟中表現(xiàn)。結(jié)果顯示生理鹽水組中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)明顯高于鋰鹽預(yù)處理組,ASDCL核陽(yáng)性治療組為8±6/HPF,而對(duì)照組21±5/HPF,p0.001。經(jīng)過(guò)60分鐘熱缺血后生理鹽水組的JNK和ERK磷酸化在再灌注后0.5h后增加了。而鋰鹽預(yù)處理組大鼠在熱I/R后出現(xiàn)JNK活性降低了。此外,ERK磷酸化鋰鹽預(yù)處理組明顯高于生理鹽水組。然而,細(xì)胞內(nèi)總JNK和ERK水平并沒(méi)有受到鋰鹽的影響。在本實(shí)驗(yàn)中通過(guò)western blotting發(fā)現(xiàn)鋰鹽預(yù)處理組抑制IRI誘導(dǎo)caspase-3分裂。[結(jié)論]鋰鹽預(yù)處理的脂肪肝能改善肝IRI,鋰鹽保護(hù)脂肪肝IRI作用機(jī)制有抑制炎癥反應(yīng),抑制GSK3β活性,調(diào)控MAPK活性,抑制肝細(xì)胞凋亡,以及誘導(dǎo)肝細(xì)胞自噬。鋰鹽是一種簡(jiǎn)單、合適的方法減輕脂肪肝IRI,在肝移植中擴(kuò)大供體的來(lái)源,降低術(shù)后并發(fā)癥和死亡率的研究中是一種有前景的藥物。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R575

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1624037