本文選題：非酒精性脂肪性肝病　切入點：動物模型　出處：《安徽醫(yī)科大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：第一部分MCD+HF誘導S-D大鼠脂肪肝模型的研究[目的]科學家們長期致力于建立的脂肪肝動物模型,以期能夠更加準確的模擬NAFLD的發(fā)病機理和進展過程,以此來探索新的治療策略。然而,到目前為止,尚沒有一種模型能夠完全準確地模擬出NAFLD全部特點。在營養(yǎng)型脂肪肝模型中最常用的飼料是蛋氨酸-膽堿缺乏(methionine-choline deficiency,MCD)飼料喂養(yǎng)的模型和高脂肪(high fat,HF)喂養(yǎng)模型。前者主要缺陷是動物不僅不會出現(xiàn)體重增加,反而表現(xiàn)為體重嚴重下降,后者存在誘導結果不穩(wěn)定性。因此,本實驗擬采用混合型營養(yǎng)性(MCD+HF)大鼠模型建立不同程度脂肪肝模型,確定其穩(wěn)定性和適用性,以適用于本實驗下一步研究。[方法]用正常大鼠飼料和MCD+HF復合型飼料2種不同飼料喂食Sprague-Dawley(S-D)大鼠誘導肝臟脂肪變性,分別為正常對照組和NAFLD組。S-D大鼠用正常飼料喂養(yǎng)直至體重達到250-320g,然后進入實驗,每組6只大鼠,分別用正常飼料和MCD+HF分別1,2,4,6周和3個月。每天記錄下大鼠體重。在喂養(yǎng)終點,大鼠被麻醉后開腹后,收集肝臟標本用于分子生物學檢測,并收集血液做生化分析。肝臟脂肪變性從三個方面來評估:(1)肝臟脂肪變性程度:大體肉眼描述性定性評估,肝臟-體重比,組織學對肝臟中脂肪蓄積分布的評估;(2)肝臟損傷程度,用組織學標準定性評估肝臟損傷,測量肝酶水平來定量分析肝臟損傷情況;(3)肝臟代謝功能:通過評估LPO和肝臟GSH來評價肝臟代謝障礙,定量分析LPO和肝總GSH是反映氧應激和抗氧化能力的指標。[結果]所有進入實驗動物均存活。NAFLD組中使用MCD+HF飼養(yǎng)沒有影響到大鼠的正常生長和壽命。3個月喂養(yǎng)后,兩組大鼠的體重增加到400-450g,體重增加明顯,結果兩組數(shù)據(jù)無差異。1-2周后,NAFLD組的肝臟與對照組相比出現(xiàn)增大,脂肪增多,肝臟表面變黃。肝臟邊緣變圓鈍,肝臟質地開始出現(xiàn)輕度柔軟感。大約在4-6周時,肉眼觀表現(xiàn)更加明顯,之后出現(xiàn)輕度的好轉。NAFLD組絕對肝切除量在第4,6周和3個月時,明顯重于對照組(13.80±1.79 vs 8.76±0.92,14.20±1.15vs 8.75±0.91,12.56±1.03 vs 8.78±0.82,p0.05,單位g)。而各時間段的肝-體重比,NAFLD組均明顯高于對照組(4.05±0.35 vs 3.22±0.21,4.51±0.27 vs 3.22±0.22,5.42±0.74 vs 3.23±0.21,5.52±0.26 vs 3.22±0.20,4.48±0.30 vs 3.24±0.19,p0.05,單位g)。在NAFLD組,第1周喂養(yǎng)時,肝細胞出現(xiàn)輕度到中度小泡型脂肪變和輕度的大泡型脂肪變,其程度越15%左右,為輕度肝脂肪變性。小泡型脂肪變主要出現(xiàn)在中央周圍區(qū)(1區(qū))和3區(qū),而混合型脂肪變主要出現(xiàn)在2區(qū)。喂養(yǎng)2周后,肝臟出現(xiàn)中等混合型空泡脂肪變,脂肪變性程度約32%,呈中度肝脂肪變性。大泡型脂肪變主要分布在1和2區(qū),小泡型脂肪變主要分布在3區(qū),混合型空泡脂肪變主要分布在1和2區(qū)。在4周末,肝臟出現(xiàn)嚴重混合型脂肪變,脂肪變性程度約占63%,為重度肝脂肪變性。大泡型脂肪變主要分布在1和2區(qū),而小泡型分布在3區(qū)。在第6周末,肝臟脂肪變類型與分布與4周時觀察基本一致。但是脂肪變嚴重程度有所減輕。在3個月末,以重度肝脂肪變性為表現(xiàn),主要是以1區(qū)和2區(qū)大泡型空泡變,和3區(qū)混合型空泡樣變性。NAFLD組大鼠出現(xiàn)輕度的肝損害表現(xiàn),主要是肝酶的釋放。在喂養(yǎng)1-2周時開始出現(xiàn)轉氨酶的升高,4周時達到最高值,主要是以AST升高明顯。ALT在所有觀察點均數(shù)沒有超過100IU/L,在第6周時比對照組有明顯增高(89.50±29.83 vs 42.50±5.51,p0.05,單位IU/L)。NAFLD組釋放AST水平在第4,6周和第3月時明顯高于對照組(210.17±95.28 vs92.03±23.70,199.67±54.06 vs 90.03±21.70,140.01±22.73 vs 90.03±21.70,p0.05,單位IU/L)并且與隨肝脂肪變性嚴重程度改變而改變。NAFLD組大鼠肝臟組織發(fā)現(xiàn)了LPO的升高(68.7±14.0 vs 53.2±2.8,120.6±18.3 v 53.1±2.7,150.3±43.0 vs53.3±2.5,168.7±44.5 vs 52.8±3.0,148.1±26.7 vs 53.3±2.7,p0.05,單位μg/g)。NAFLD組誘導出GSH的下降,從第一周飼養(yǎng)開始,GSH值就開始下降到,在3個月末期,GSH有輕度上升(2476.4±67.7 vs 3698.3±122.8,2371.8±127.3 vs3720.2±117.5,2237.9±118.1 vs 3710.7±102.8,2399.1±60.8 vs 3701.4±98.8,2426.6±113.5 vs 3710.2±103.4,p0.05,單位μg/g)。[結論]MCD+HF飼料能誘導S-D大鼠肝脂肪變性。在整個飼養(yǎng)過程中,無一死亡動物,具有良好的動物耐受性。MCD+HF該種飼養(yǎng)方法能誘導出S-D大鼠輕、中、重度脂肪肝模型,并且方法可靠,穩(wěn)定。該模型符合有關脂肪肝對缺血再灌注損傷相關研究的要求,根據(jù)研究需要選擇MCD+HF飼養(yǎng)2~4周的大鼠。第二部分鋰鹽對大鼠肝臟缺血再灌注損傷的保護作用[目的]已經(jīng)被廣泛應用于治療精神疾病精神類藥物--鋰鹽,被證實在很多器官缺血再灌注損傷具有保護作用。本部分研究為解決鋰鹽在正常肝臟IRI中的作用機制如何,以為下一部分脂肪肝IRI研究打下基礎。[方法]S-D大鼠用正常飼料喂養(yǎng)直至標準體重,然后進入實驗。在喂養(yǎng)期的最后3天,實驗組給于鋰劑,對照組給于生理鹽水,鋰鹽組在IRI后2天內每天再次給藥。之后給予手術加以60min選擇性熱缺血處理。再灌注后0.5h,6h,24h,48h分別處死。切取左外葉和右葉作為組織學分析。收集右中葉和血清做分子生物學分析。本實驗切片復水后用ASDCL染色來研究肝再灌注后中性粒細胞浸潤。隨機選取10個高倍視野(HPF,400×)采用手動計數(shù)ASDCL陽性中性粒細胞。HMGB1免疫組化和ELISA法了解HMGB1在肝IRI是否存在移位現(xiàn)象以及血清中HMGB1含量。蛋白免疫印跡檢測再灌注后不同時間點的GSK3β,p-GSK3βSer9,ERK,p-ERK,p38,p-p38,JNK,p-JNK,caspase-3,LC3,p-62的表達變化。分析鋰鹽是否影響炎癥反應,自噬水平以及GSK3β和MAPK信號途徑。[結果]本實驗檢測鋰鹽組再灌注后的0.5h,6h,24h,48h組與生理鹽水組的肝酶學變化。經(jīng)過60分鐘熱缺血處理后,血清ALT水平在再灌注后0.5h出現(xiàn)升高,6h后達到高峰,之后開始下降。而鋰鹽處理組在再灌注后對應時間點出現(xiàn)明顯下降(ALT釋放水平分別為596±171 vs 392±126,823±155 vs 604±119,221±34 vs147±34,73±5 vs 62±9,各組p0.05,單位IU/L;AST釋放水平為574±140 vs371±101,892±160 vs 594±127,426±35 vs 363±45,110±20 vs 98±11,各組p0.05,單位IU/L)。ASDCL染色陽性細胞結果顯示鋰鹽處理組中性粒細胞浸潤明顯要低于生理鹽水組大鼠,鋰鹽處理組:9±1/HPF;生理鹽水組:14±4/HPF,p0.05。肝臟IR后,HMGB1表達上調,并且從細胞核外移到細胞漿中。本實驗采用ELISA方法檢測肝缺血再灌注后HMGB1表達,在生理鹽水組合鋰鹽處理組中均有HMGB1表達升高,而鋰鹽處理組的HMGB1明顯低于生理鹽水組,在0.5h組內生理鹽水組HMGB1高于鋰鹽組約3倍。本實驗通過60分鐘熱缺血再灌注后不同時間點了解缺血再灌注有GSK3β磷酸化水平。與正常未處理組比較,再灌注后0.5h磷酸化的GSK3β/Ser9水平快速下降,并保持去磷酸化狀態(tài)。而鋰鹽處理組的磷酸化GSK3β/Ser9水平高于生理鹽水組大鼠。鋰鹽處理組并不影響細胞內總GSK3β水平。本實驗為了解鋰鹽是否能影響肝缺血再灌注后MAPK激活,檢測了ERK,JNK與p38的磷酸化水平。結果顯示在生理鹽水組再灌注后0.5h,ERK,JNK和p38磷酸化增加。而鋰鹽處理組在再灌注后0.5h,ERK磷酸化水平高于生理鹽水組。JNK和p38磷酸化水平是下降的。鋰鹽處理組并沒有影響到整個細胞水平的ERK,JNK和p38表達。本實驗通過研究凋亡蛋白caspase-3表達了解鋰鹽在缺血再灌注損傷中對凋亡的影響。相對于生理鹽水組,鋰鹽處理組的大鼠熱缺血再灌注后caspase-3分裂在0.5h,6h時被抑制。本實驗為證明鋰鹽是否能誘導肝臟IRI肝細胞自噬,檢測自噬蛋白LC3和p62在鋰鹽處理組和生理鹽水處理組表達水平。在熱缺血60分鐘后,LC3-II表達在整個再灌注過程中升高,在鋰鹽處理組中LC3-II表達明顯升高。而p62表達在再灌注后各個時間段均有明顯下降,且鋰鹽處理組要低于生理鹽水組。[結論]鋰鹽具有保護肝IRI的作用。鋰鹽保護肝IRI作用機制可能包括抑制炎癥反應,抑制GSK3β活性,調控MAPK活性,抑制肝細胞凋亡,以及誘導肝細胞自噬。第三部分鋰鹽對大鼠脂肪肝缺血再灌注損傷的保護作用及其機制研究[目的]本實驗通過建立脂肪肝動物模型來研究鋰鹽在肝臟缺血再灌注損傷中作用及其分子機制,為臨床降低NAFLD患者行肝臟手術損傷提供理論基礎。[方法]標準體重S-D大鼠用MCD+HF飼料喂養(yǎng)2周,建立中度脂肪肝模型。在行手術前3天,實驗組給于鋰劑,對照組給于生理鹽水。之后給予手術加以60min選擇性熱缺血處理。再灌注后0.5h,6h,24h,48h分別處死。切取左外葉和右上葉做組織學分析,收集右中葉和血清做分子生物學分析。本實驗用水化切片ASDCL染色來研究肝再灌注后中性粒細胞浸潤。隨機選取10個高倍視野(HPF,400×)采用手動計數(shù)ASDCL陽性中性粒細胞。HMGB1免疫組化了解HMGB1在肝IRI是否存在移位現(xiàn)象,用ELISA方法檢測血清HMGB1含量。蛋白免疫印跡檢測再灌注后不同時間點的GSK3β,p-GSK3βSer9,ERK,p-ERK,JNK,p-JNK,caspase-3,LC3,p-62的表達變化。分析鋰鹽是否影響脂肪肝IRI的炎癥反應,自噬水平以及GSK3β和MAPK信號途徑。[結果]S-D大鼠用MCD+HF喂養(yǎng)2周后表現(xiàn)為中度肝臟脂肪變性。本實驗通過檢測鋰鹽組再灌注后的0.5h,6h,24h,48h組與生理鹽水組的肝酶學變化,證明鋰鹽有降低脂肪肝臟ALT,AST釋放水平作用。經(jīng)過60分鐘熱缺血處理后,血清ALT和AST顯著升高。二者均再灌注后0.5h血清ALT升高,6h后達到峰值,之后下降。鋰鹽明顯減輕IRI肝損傷作用,表現(xiàn)為血清中ALT和AST水平相對更低(ALT釋放水平402±120 vs 616±171,p0.05;450±102 vs 860±134,p0.05;310±52 vs 402±44,p0.05;198±34 vs 210±35,p0.05;AST釋放水平391±127 vs598±139,p0.05;657±178 vs 1123±234,p0.05;610±56 vs 178±18,p0.05;788±98 vs 245±36,p0.05;單位:IU/L)。S-D大鼠喂養(yǎng)MCD+HF飼料2W后檢查肝臟自噬蛋白表達。自噬蛋白LC3-II的表達在脂肪肝細胞中顯著降低,而自噬蛋白p62的表達在脂肪肝細胞中顯著增加。而經(jīng)過60分鐘熱缺血脂肪肝大鼠LC3-II表達水平,在各個時間段顯示鋰鹽處理組表達水平明顯升高,且與生理鹽水組比較有明顯升高,同時鋰鹽組相對于生理鹽水組顯著降低了p62的蛋白表達水平。本實驗發(fā)現(xiàn),在再灌注后0.5h GSK3β/Ser9磷酸化水平迅速升高,隨著6h后輕度降低后再次升高,在24小時后達到峰值。與生理鹽水組水平相比,鋰鹽預處理組的GSK3β/Ser9磷酸化水平更高一些,而細胞總GSK3β水平?jīng)]有受到鋰鹽影響。而再灌注后0.5h生理鹽水組中脂肪肝細胞核內HMGB1染色明顯減少,免疫組化結果顯示HMGB1陰性核率:鋰鹽處理組3.42±1.04%,而生理鹽水組為6.18±1.21%,p0.01。本實驗采用ELISA方法檢測肝缺血再灌注后HMGB1表達,在生理鹽水組合鋰鹽處理組中均有HMGB1表達升高,而0.5h,6h組鋰鹽處理組的HMGB1顯著低于生理鹽水組。本實驗通過檢測ASDCL印跡陽性中性粒細胞浸潤在熱缺血60min再灌注24小時后脂肪肝大鼠肝臟中表現(xiàn)。結果顯示生理鹽水組中性粒細胞浸潤明顯高于鋰鹽預處理組,ASDCL核陽性治療組為8±6/HPF,而對照組21±5/HPF,p0.001。經(jīng)過60分鐘熱缺血后生理鹽水組的JNK和ERK磷酸化在再灌注后0.5h后增加了。而鋰鹽預處理組大鼠在熱I/R后出現(xiàn)JNK活性降低了。此外,ERK磷酸化鋰鹽預處理組明顯高于生理鹽水組。然而,細胞內總JNK和ERK水平并沒有受到鋰鹽的影響。在本實驗中通過western blotting發(fā)現(xiàn)鋰鹽預處理組抑制IRI誘導caspase-3分裂。[結論]鋰鹽預處理的脂肪肝能改善肝IRI,鋰鹽保護脂肪肝IRI作用機制有抑制炎癥反應,抑制GSK3β活性,調控MAPK活性,抑制肝細胞凋亡,以及誘導肝細胞自噬。鋰鹽是一種簡單、合適的方法減輕脂肪肝IRI,在肝移植中擴大供體的來源,降低術后并發(fā)癥和死亡率的研究中是一種有前景的藥物。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R575

【參考文獻】

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本文編號：1624037