本文選題：燒傷　切入點：谷氨酰胺　出處：《第三軍醫(yī)大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：嚴重燒傷能夠引發(fā)腸道炎癥和氧化應激,引起腸道損傷,最終導致腸道屏障破壞及腸道功能紊亂。研究發(fā)現(xiàn)單獨應用谷氨酰胺(Glutamine,Gln)或益生菌(probiotics)都能降低腸道炎癥和腸道損傷。已有的研究認為谷氨酰胺能給腸道補充營養(yǎng)并能抑制機體的氧化應激和炎癥反應,而益生菌能夠調整腸道微生態(tài)并起到保護腸道及抑制腸道炎癥反應的作用,但是其相關詳細機理尚未明確。聯(lián)合應用谷氨酰胺和益生菌是否能更有效降低腸道炎癥和氧化應激進而更好的保護腸道,現(xiàn)無明確定論。動物實驗發(fā)現(xiàn)重度燒傷的大鼠模型腸道中一氧化氮(NO)明顯增高,提示NO在燒傷引發(fā)腸道炎癥和氧化應激中起重要作用。NO是重要的生理活性物質,其表達在正常情況下維持機體的生理機能。當NO異常增高會導致機體氧化應激和炎癥反應的出現(xiàn)。由于谷氨酰胺、益生菌能抑制燒傷引發(fā)腸道炎癥和氧化應激反應,而燒傷又能刺激腸道大量釋放NO,故我們推測谷氨酰胺或益生菌的應用可能通過抑制腸道NO異常增高來發(fā)揮腸道保護作用,它們聯(lián)合應用能夠增強彼此抗氧化應激和抗炎癥的能力,可能更有效發(fā)揮對腸道保護的功效。因此,我們擬通過大鼠重度燙傷模型研究谷氨酰胺和益生菌聯(lián)合應用對腸道的保護作用以及了解聯(lián)合應用是否通過降低腸道中NO來抑制腸道炎癥和氧化應激,并深入闡明其相關機制。本研究發(fā)現(xiàn)嚴重燒傷能激活腸道大量合成NO,并引起腸道爆發(fā)氧化應激及炎癥反應,導致腸道損傷。不僅如此我們還發(fā)現(xiàn)在燒傷后氧化應激反應是先于炎癥反應,有效降低氧化應激反應就能減少機體及腸道炎癥因子的釋放。進一步研究還發(fā)現(xiàn),誘導型一氧化氮合酶(iNOS)通過NF-κB激活炎癥反應,而抑制iNOS能有效降低機體及腸道的炎癥反應。燒傷通過影響了iNOS基因高度甲基化狀態(tài)導致iNOS異常表達,谷氨酰胺和益生菌聯(lián)合應用能通過增強iNOS基因的甲基化水平而降低NO的合成及釋放,最終抑制了燒傷引發(fā)的腸道氧化應激和炎癥反應。因此,iNOS在燒傷引起的氧化應激和炎癥反應中發(fā)揮了重要作用。谷氨酰胺和益生菌聯(lián)合應用可通過調控iNOS基因的甲基化而抑制腸道氧化應激和炎癥反應,進而保護腸道免于炎癥引發(fā)的損傷。重度燒傷早期機體有大量體液滲出,且機體嚴重的應激反應使體內血流重分布,導致腸道血流量顯著下降,引發(fā)腸道缺氧及營養(yǎng)和能量的缺乏,從而誘發(fā)氧化應激和炎癥反應介導腸道損傷。腸道損傷后會發(fā)生腸上皮細胞的凋亡和壞死,導致腸黏膜通透性增強,腸道內的細菌和大分子物質容易通過腸壁進入血液,加重了氧化應激和炎癥反應,進一步破壞腸道的機械屏障和免疫屏障,發(fā)展為全身性的感染。因此,嚴重燒傷的腸道保護在燒傷治療中占據(jù)重要的地位。谷氨酰胺作為腸上皮細胞的主要能源物質在嚴重燒傷后會顯著減少,研究發(fā)現(xiàn)嚴重燒傷后補充谷氨酰胺能夠明顯抑制腸道的炎癥反應,維持腸道機械屏障,因而對燒傷后腸道具有強烈的保護作用。益生菌能調節(jié)腸道菌群,抑制有害菌的增殖,糾正腸道功能紊亂,同樣對腸道的屏障功能具有明顯的保護作用。谷氨酰胺和益生菌聯(lián)合應用可能會更好的發(fā)揮對腸道的保護作用。如前所述,NO在重度燒傷動物模型的腸道中異常合成并大量釋放,它可能是燒傷后腸道釋放的重要應激分子及腸道損傷的主要因素。谷氨酰胺和益生菌聯(lián)合應用可能通過抑制NO異常釋放進而降低腸道損傷并保護腸道。NO是一種在胃腸道內廣泛分布的生理活性物質,生理狀態(tài)下其參與了胃腸道的運動及胃腸道粘膜的保護,而在燒傷、腸道炎癥等情況下,NO則參與或加重腸道炎癥反應。NO是由一氧化氮合酶(NOS)催化L-精氨酸而生成。目前已知NOS有神經(jīng)型NOS(n NOS)、內皮型NOS(e NOS)及誘導型NOS(iNOS),前兩者稱為結構型NOS(c NOS)。c NOS合成少量NO發(fā)揮生理效應,iNOS則可產(chǎn)生的過量NO而發(fā)揮有害效應。因此iNOS表達量是NO異常產(chǎn)生的關鍵。iNOS表達受到其DNA甲基化水平的調控,以往研究發(fā)現(xiàn)正常情況下機體中iNOS基因保持著高水平的甲基化狀態(tài)并有效阻止iNOS的轉錄和表達。但在機體受到刺激或嚴重燒傷時iNOS的表達出現(xiàn)異常增高。iNOS基因的甲基化水平可能發(fā)生改變,從而影響iNOS的表達。由此我們推測,谷氨酰胺和益生菌保護腸道和抑制氧化應激的作用可能是通過調控iNOS基因的甲基化狀態(tài),從而抑制燒傷引發(fā)的腸道炎癥反應及損傷。本研究發(fā)現(xiàn)燒傷能夠刺激機體及腸道產(chǎn)生大量的NO、ROS、MDA并導致SOD活力降低,也能刺激機體及腸道釋放炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-8,同時減少機體中IL-4的產(chǎn)生。通過聯(lián)合應用谷氨酰胺和益生菌能夠有效降低氧化應激標志物及炎癥因子的釋放,并對腸道屏障起保護作用。為明確NO是否在燒傷引發(fā)的腸道炎癥中的作用和地位,我們采用NOS抑制劑L-NAME干預處理燙傷大鼠模型。實驗發(fā)現(xiàn)大鼠燒傷后血液中TNF-α、IL-6增高時間比ROS、NO、MDA要晚,提示燒傷引發(fā)機體氧化應激早于炎癥反應。L-NAME不僅有效抑制了腸道iNOS表達和NO合成,也能明顯降低氧化應激指標(ROS、MDA)的水平和提高SOD活性以及減少炎癥因子(TNF-α、前言IL-6)的產(chǎn)生,從而抑制了腸道的氧化應激和炎癥反應。聯(lián)合應用谷氨酰胺和益生菌與應用L-NAME抑制劑有類似效果,說明聯(lián)合應用通過抑制NO合成降低了氧化應激及炎癥反應,而iNOS是NO合成和釋放的關鍵因素。而與以往研究不同的是,我們還證實了iNOS是通過對NF-κB的調控進而影響炎癥反應。我們研究還發(fā)現(xiàn)谷氨酰胺和益生菌聯(lián)合應用能夠通過提高iNOS基因的甲基化水平來抑制iNOS的表達,從而減少NO的異常合成,同時其能提高PPARγ的表達,從而降低了腸道炎癥和氧化損傷�？傊�,我們的研究不僅闡明了iNOS在燒傷引發(fā)腸道氧化應激和炎癥反應中的重要作用,也初步探討了谷氨酰胺和益生菌聯(lián)合應用在有效抑制iNOS表達、減少燒傷引發(fā)的腸道炎癥和損傷作用中的分子機制。研究目的1.明確嚴重燒傷所引起的機體及腸道氧化應激和炎癥反應的相關機制及iNOS在其中發(fā)揮的作用;2.探討谷氨酰胺和益生菌聯(lián)合應用治療燒傷引發(fā)的腸道損傷的藥效和機制;3.闡明燒傷所誘發(fā)iNOS在腸道中高表達的原因及探討谷氨酰胺和益生菌聯(lián)合應用對iNOS表達的表觀遺傳學影響。材料和方法一、燒傷模型的建立、干預措施及取材1.雄性Wistar大鼠110只(8周齡,140g-185g),由第三軍醫(yī)大學實驗動物中心提供。分組如下(根據(jù)實驗設計分成兩個大組):(1)對照組;模型組;谷氨酰胺治療組;益生菌治療組;谷氨酰胺+益生菌治療組;(2)對照組;模型組;L-NAME(NOS抑制劑)組。致傷大鼠麻醉后將背部脫毛區(qū)浸以100℃沸水15s,制成20%體表面積全層皮膚燙傷模型。對照組則在大鼠麻醉后將背部脫毛區(qū)浸于25℃溫水中15s。2.實驗Ⅰ:對照組:1ml生理鹽水灌胃;模型組:致傷后1ml生理鹽水灌胃;谷氨酰胺治療組:致傷后谷氨酰胺(1.5g/kg)+1ml生理鹽水灌胃;益生菌治療組:致傷后益生菌(300mg/kg)+1ml生理鹽水灌胃;谷氨酰胺+益生菌治療組:致傷后谷氨酰胺(1.5g/kg)+益生菌(300mg/kg)+1ml生理鹽水灌胃。干預措施均為1次/d,連續(xù)7d。于傷后第7d,將各組大鼠麻醉并取腸管及血液樣本。3.實驗Ⅱ:對照組及模型組致傷后即尾靜脈注射1ml生理鹽水;L-NAME組致傷后即尾靜脈注射L-NAME HCL(100mg/kg)。對照組、模型組和L-NAME組大鼠分別于傷后0、1、6,24h收集血液標本,于傷后24h麻醉后取腸組織樣本。二、生化指標檢測1.IL-6、IL-4、IL-8、TNF-α:酶聯(lián)免疫吸附法和熒光檢測法。2.ROS、SOD、MDA:化學發(fā)光法。3.NO:NO檢測試劑盒。三、q RT-PCR(Quantitative real-time polymerase chain reaction)檢測以各組大鼠腸管提取總RNA,經(jīng)反轉錄后,使用q RT-PCR技術檢測各組樣本的iNOS、e NOS、n NOS、NF-κB、Bax、EGF、IL-6、TNF-α、s ICAM-1、s VCAM-1、PPARγ、DNMT-1、Tet1及GADPH的m RNA表達水平。四、TUNNEL檢測通過TUNNEL試劑盒檢測腸道細胞凋亡情況,測100μm2凋亡細胞個數(shù)。五、HE檢測對各組大鼠的腸道樣本進行HE染色,觀察各組大鼠腸道損傷情況。六、Western blot(WB)用SDS PAGE凝膠電泳分離轉移各組別腸道蛋白并將蛋白轉到PVDF膜上。脫脂奶粉封閉后分別孵以NF-κB、EGF、Bax、IKKB、PERK、ERK、P100、P52、DNMT-1、Tet1、iNOS、e NOS、n NOS、PPARγ和GAPDH抗體。在孵以辣根過氧化物酶標記羊抗兔二抗后以ECL法檢測蛋白表達強度。七、甲基化特異性PCR檢測(Methylation-Specific PCR,MS-PCR)DNA甲基化狀態(tài)制備基因組DNA,DNA在亞硫酸氫鹽處理后,采用DNA甲基化檢測試劑盒用引物進行e NOS、iNOS甲基化DNA擴增。八、數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析采用SPSS22.0軟件。數(shù)據(jù)以平均值±標準差的形式表示。組間比較采用單因素方差分析,P0.05認為存在統(tǒng)計學差異。研究結果一、燒傷可誘發(fā)機體及腸道的氧化應激和炎癥反應,谷氨酰胺和益生菌聯(lián)合應用能夠有效控制氧化應激和炎癥反應的程度。采用化學發(fā)光法檢測大鼠燙傷后血液中氧化應激的指標,發(fā)現(xiàn)NO、ROS、MDA在燒傷后處于增高狀態(tài),且SOD的活力受到嚴重抑制。ELISA檢測發(fā)現(xiàn)血液中IL-6、TNF-α、IL-8均增高,而IL-4降低。谷氨酰胺和益生菌聯(lián)合應用能夠有效降低ROS、MDA、NO、TNF-a、IL-6、IL-8在血液中的含量、增高IL-4含量并顯著提高SOD活力。腸組織的氧化應急指標及炎癥因子的檢測結果顯示,除IL-4無明顯變化外,其余指標的變化與血液中的變化趨勢相同。實驗結果說明燒傷誘發(fā)了機體及腸道的氧化應激和炎癥反應,谷氨酰胺和益生菌聯(lián)合應用可顯著改善機體及腸道的氧化應激和炎癥狀態(tài)。二、燒傷后NO表達水平可影響機體及腸道的氧化應激和炎癥反應,iNOS通過調控NF-κB而影響腸道炎癥反應的程度。通過q RT-PCR、WB、ELISA和化學發(fā)光法檢測L-NAME對燙傷大鼠氧化應激和炎癥反應的影響,并明確NO在其中發(fā)揮的作用。研究發(fā)現(xiàn)傷后血液中SOD、MDA、ROS、NO的改變要早于IL-6、TNF-α,提示燒傷引發(fā)的氧化應激反應要先于炎癥產(chǎn)生;傷后24h腸道NO、ROS、MDA、TNF-α、IL-6含量明顯升高,SOD明顯降低。L-NAME組腸道NO、ROS、MDA、TNF-α、IL-6含量明顯降低,SOD明顯升高。通過使用NOS抑制劑L-NAME抑制燒傷引發(fā)的NO異常合成,抑制了機體及腸道的氧化應激和炎癥反應,證實了抑制NO可減少機體及腸道的氧化應激標志物和炎癥因子的產(chǎn)生;L-NAME組iNOS表達明顯降低,NF-κB P65表達隨之降低,提示iNOS通過NF-κB而調控炎癥反應。三、谷氨酰胺和益生菌聯(lián)合應用對燒傷后腸道損傷的保護作用及相關機制。病理結果顯示谷氨酰胺和益生菌聯(lián)合應用能很好的修復腸道損傷,恢復腸道屏障功能。TUNNEL檢測表明聯(lián)合應用能明顯減少腸道細胞的凋亡,WB及q RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)聯(lián)合應用抑制促凋亡相關蛋白BAX在腸道中的表達,而增高細胞修復相關的細胞因子EGF的表達,從而減少腸道損傷并激活腸道修復。WB及q RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn),聯(lián)合應用谷氨酰胺和益生菌可有效降低腸道中iNOS的表達,其通過抑制NF-κB經(jīng)典途徑而調控炎癥和保護腸道。WB及q RT-PCR檢測還發(fā)現(xiàn)聯(lián)合應用谷氨酰胺和益生菌能夠有效增強PPARγ表達,從而抑制NF-κB通路。故谷氨酰胺和益生菌聯(lián)合應用對調控iNOS的表達及對腸道的保護具有重要的作用。四、谷氨酰胺和益生菌聯(lián)合應用可通過調控iNOS基因的甲基化水平而調控iNOS表達。MS-PCR檢測發(fā)現(xiàn),iNOS基因的DNA甲基化水平燒傷后出現(xiàn)降低,聯(lián)合應用谷氨酰胺和益生菌能夠顯著提高iNOS基因的甲基化水平,而e NOS基因的DNA甲基化水平在燒傷和聯(lián)合應用后均沒有明顯改變。WB及q RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn),燙傷后甲基化轉移酶(DNMT-1)顯著降低,去甲基化酶(Tet1)顯著升高。谷氨酰胺和益生菌聯(lián)合應用后,DNMT-1的表達水平提高,而Tet1的表達水平降低,實驗結果表明谷氨酰胺和益生菌聯(lián)合應用能夠通過調控iNOS基因的甲基化水平而調控iNOS的表達。研究結論谷氨酰胺和益生菌聯(lián)合應用能通過影響DNA甲基化酶及去甲基化酶的表達,提高iNOS基因的甲基化水平,從而使NO的表達顯著降低,進而抑制了燒傷后腸道的氧化應激及炎癥反應,減少腸道細胞凋亡,改善腸道修復功能并維護腸道的屏障功能。谷氨酰胺和益生菌聯(lián)合應用能增強PPARγ的表達進而抑制NF-κB的表達,降低了腸道炎癥反應,這可能是谷氨酰胺和益生菌聯(lián)合應用有效保護腸道的重要機制�？傊�,本研究證實燒傷導致腸道iNOS的異常表達在燒傷引發(fā)的氧化應激和炎癥反應中占據(jù)重要位置。谷氨酰胺和益生菌聯(lián)合應用通過抑制燒傷后腸道iNOS的表達而發(fā)揮保護腸道的作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R644

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本文編號：1603900