本文選題：饑餓素　切入點(diǎn)：高血壓　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：肥胖是危害人類(lèi)健康的潛在病因,且全球肥胖發(fā)生率在逐年增加。肥胖可引發(fā)多種并發(fā)癥,例如代謝綜合征、糖尿病、心血管疾病,特別是肥胖伴隨的高血壓可直接導(dǎo)致腦中風(fēng)、心肌梗死。研究表明,多種病理機(jī)制參與肥胖相關(guān)高血壓的發(fā)生與發(fā)展。例如,肥胖可改變中樞對(duì)心血管活動(dòng)的調(diào)控,增強(qiáng)交感神經(jīng)傳出活動(dòng)。此外,肥胖可直接引起外周血管收縮功能增強(qiáng)、外周阻力增加。兩者共同作用引起動(dòng)脈血壓升高。饑餓素(orexin)是中樞下丘腦外側(cè)核合成的興奮性肽類(lèi)物質(zhì),于1988年被兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室?guī)缀跬瑫r(shí)發(fā)現(xiàn)并報(bào)道。Orexin分為兩種:orexin A以及orexin B,可通過(guò)與兩種G蛋白偶聯(lián)受體-饑餓素受體1(orexin receptor1,OXR1)和饑餓素受體2(orexin receptor 2,OXR2)結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。雖然饑餓素的合成僅在下丘腦外側(cè)核團(tuán),但其神經(jīng)纖維廣泛投射于中樞神經(jīng)系統(tǒng),參與廣泛的機(jī)體活動(dòng)調(diào)節(jié),例如飲食、睡眠、覺(jué)醒、應(yīng)激等。眾多研究發(fā)現(xiàn),饑餓素及其受體對(duì)心血管活動(dòng)的基礎(chǔ)活動(dòng)具有重要的維持作用,并且與高血壓發(fā)生有關(guān)。在orexin基因敲除的小鼠,其外周動(dòng)脈血壓明顯低于對(duì)照正常小鼠,提示orexin是維持正常心血管活動(dòng)必不可少的因素。在血壓正常的WKY大鼠,微量注射饑餓素于心血管調(diào)控中樞-延髓頭端外側(cè)區(qū)(rostral ventralateral medulla,RVLM)可引起外周動(dòng)脈血壓升高;相反,在自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneous hypertensive rats,SHR),RVLM微量注射饑餓素受體阻斷劑可顯著降低外周動(dòng)脈血壓。電生理學(xué)研究顯示,給予orexin可引起RVLM、孤束核(NTS)、及下丘腦外側(cè)核神經(jīng)元去極化,導(dǎo)致神經(jīng)元自發(fā)放電頻率增加。進(jìn)一步研究表明,orexin對(duì)中樞神經(jīng)元的興奮作用與L型Ca2+通道活動(dòng)增強(qiáng)、興奮性突觸前電流以及非選擇性突觸后陽(yáng)離子電流(non-selective canton current,NSCC)增強(qiáng)有關(guān)�？傊�,orexin及其受體對(duì)心血管中樞具有重要的調(diào)節(jié)作用,其功能增強(qiáng)可能是導(dǎo)致動(dòng)脈血壓升高的重要病理生理學(xué)機(jī)制之一。下丘腦室旁核(paraventricular nucleus,PVN)是連接機(jī)體神經(jīng)-內(nèi)分泌調(diào)節(jié)的重要核團(tuán),參與機(jī)體飲食、睡眠、能量代謝等多種生理功能的調(diào)節(jié)。神經(jīng)解剖學(xué)顯示,下丘腦PVN神經(jīng)元可直接投射到多個(gè)心血管中樞部位,例如RVLM和NTS。尤其值得關(guān)注的是,PVN神經(jīng)元可直接投射到胸段脊髓中間外側(cè)柱,通過(guò)脊髓交感節(jié)前神經(jīng)元直接參與對(duì)交感神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)。在體動(dòng)物研究結(jié)果顯示,PVN注射中樞興奮性遞質(zhì)谷氨酸受體(NMDA受體)阻斷劑可顯著降低自發(fā)性高血壓大鼠腎交感神經(jīng)傳出活動(dòng),引起血壓下降;同樣,給予PVN抑制性遞質(zhì)GABA受體激動(dòng)劑亦引起血壓降低并伴有交感活動(dòng)降低;結(jié)果提示PVN在中樞血壓調(diào)控中發(fā)揮重要作用。肥胖Zucker大鼠(obesity Zucker rats,OZRs)由于瘦素受體突變導(dǎo)致其功能缺失,從而進(jìn)食增加,導(dǎo)致肥胖。大量研究表明,成年OZRs較正常Zucker大鼠(lean Zucker rats,LZRs)血壓升高,外周交感活動(dòng)增強(qiáng)。OZRs已作為肥胖性高血壓模型應(yīng)用于高血壓機(jī)制的研究。因此,本研究采用肥胖Zucker大鼠探討下丘腦PVN饑餓素及其受體在肥胖相關(guān)高血壓中的作用及其中樞機(jī)制。第一部分:下丘腦室旁核饑餓素及其受體對(duì)肥胖Zucker大鼠動(dòng)脈血壓的調(diào)節(jié)作用目的:觀察下丘腦PVN饑餓素受體在肥胖Zucker大鼠動(dòng)脈血壓調(diào)控中的作用。方法:成年OZRs以及LZRs在麻醉狀態(tài)下,機(jī)械通氣維持呼吸,股動(dòng)脈插管檢測(cè)動(dòng)脈血壓;通過(guò)記錄左側(cè)腎交感神經(jīng)放電(renal sympathetic nerve activity,RSNA)反映交感神經(jīng)系統(tǒng)活動(dòng);PVN微量注射orexin A、OXR1以及OXR2選擇型受體阻斷劑,觀察對(duì)動(dòng)物血壓以及RSNA的影響。通過(guò)western blot檢測(cè)PVN中兩種orexin受體變化。為排除體重對(duì)動(dòng)脈血壓的影響,采用tail cuff方法觀察6周齡清醒大鼠收縮壓,以及采用western blot測(cè)定PVN中兩種受體的變化。結(jié)果:基礎(chǔ)狀態(tài)下,OZRs平均動(dòng)脈壓(mean blood pressure,MAP)以及心率(heart rate,HR)顯著高于LZRs;PVN微注射OXR1選擇性阻斷劑SB334867可顯著降低OZRs的MAP、HR以及RSNA,但不能降低LZRs的MAP、HR和RSNA。而OXR2選擇性阻斷劑對(duì)LZRs和OZRs的血流動(dòng)力學(xué)以及RSNA均無(wú)影響。以上結(jié)果提示,PVN中OXR1而非OXR2在OZRs大鼠血壓調(diào)控中發(fā)揮作用。進(jìn)一步研究顯示,PVN微量注射orexin A可劑量依賴(lài)性地增加兩組大鼠的動(dòng)脈血壓、心率及RSNA,但orexin A對(duì)OZRs的升壓效應(yīng)顯著高于LZRs,提示OZRs PVN中OXR1功能增強(qiáng)。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,OZRs PVN中OXR1表達(dá)較LZRs顯著升高,而OXR2表達(dá)在兩組大鼠之間無(wú)顯著差異。為排除體重肥胖對(duì)血壓的影響,我們檢測(cè)了6周LZRs和OZRs的動(dòng)脈血壓以及PVN中兩種orexin受體的變化,結(jié)果顯示,雖然5周OZRs體重較LZRs顯著增加,但兩組動(dòng)物之間收縮壓以及兩種orexin受體均無(wú)顯著差異,提示OZRs高血壓與其肥胖無(wú)關(guān)。小結(jié):肥胖Zucker大鼠由于PVN中OXR1表達(dá)上調(diào),導(dǎo)致外周交感傳出活動(dòng)增強(qiáng),心率加快,引起動(dòng)脈血壓升高。第二部分:饑餓素1型受體對(duì)肥胖Zucker大鼠下丘腦室旁核交感前神經(jīng)元興奮性的調(diào)節(jié)作用目的:探討?zhàn)囸I素受體對(duì)下丘腦PVN交感前神經(jīng)元興奮性的影響及其機(jī)制。方法:成年OZRs以及LZRs在麻醉狀態(tài)下,機(jī)械通氣維持呼吸,股動(dòng)脈插管檢測(cè)動(dòng)脈血壓;脊髓胸段T3-T4中間外側(cè)柱微量注射紅色熒光染料逆行追蹤標(biāo)記下丘腦PVN交感前神經(jīng)元;全細(xì)胞電流鉗用于記錄交感前神經(jīng)元的自發(fā)放電頻率(renal sympathetic nerve activity,RSNA)以及膜電位(membrane potential,MP);全細(xì)胞電壓鉗記錄最小突觸前興奮性膜電流(miniature excitatory presynaptic currents,m EPSC)以及非選擇性陽(yáng)離子電流(non-selective cation currents,NSCC);應(yīng)用免疫熒光技術(shù)確定交感前神經(jīng)元orexin受體表達(dá),進(jìn)一步明確orexin A對(duì)PVN交感前神經(jīng)元的作用是通過(guò)orexin受體所發(fā)揮。結(jié)果:基礎(chǔ)狀態(tài)下,OZRs PVN中交感前神經(jīng)元MP及其RF均顯著高于LZRs。鑒于第一部分在體實(shí)驗(yàn)提示在OZRs大鼠PVN中OXR1介導(dǎo)的升壓效應(yīng)顯著大于LZRs,首先給予OXR1選擇性阻斷劑SB334867,觀察交感前神經(jīng)元MP和RF的變化。結(jié)果顯示,阻斷OXR1對(duì)LZRs大鼠交感前神經(jīng)元MP和RF無(wú)影響,提示其興奮性無(wú)顯著改變。而在OZRs大鼠,交感前神經(jīng)元MP和RF顯著下降,提示其興奮性降低。然而給予OXR2選擇性阻斷劑TCS209對(duì)兩組大鼠交感前神經(jīng)元MP和RF均無(wú)顯著影響,提示OXR2與大鼠PVN交感前神經(jīng)元興奮性無(wú)關(guān)。為進(jìn)一步明確上述阻斷劑是通過(guò)阻斷orexin受體發(fā)揮作用,給予orexin A,觀察PVN交感前神經(jīng)元MP和RF的變化。結(jié)果顯示,orexin A可劑量依賴(lài)性地興奮兩組大鼠PVN交感前神經(jīng)元,增強(qiáng)MP和RF。orexin A對(duì)OZRs的興奮性增強(qiáng)效應(yīng)顯著高于LZRs。orexin A介導(dǎo)的PVN交感前神經(jīng)元興奮性增強(qiáng)效應(yīng)可被SB334867預(yù)處理所阻斷,而TCS209預(yù)處理對(duì)此興奮性增強(qiáng)效應(yīng)無(wú)影響。此外,形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示,PVN中逆行標(biāo)記的交感前神經(jīng)元95%以上顯示為OXR1陽(yáng)性,并且兩組大鼠之間無(wú)顯著差異。為明確orexin A的興奮作用是通過(guò)突觸前或突觸后所實(shí)現(xiàn),在全細(xì)胞電壓鉗實(shí)驗(yàn)中給予TTX處理。結(jié)果顯示,兩組大鼠PVN交感前神經(jīng)元m EPSC無(wú)顯著差異,并且orexin A對(duì)兩組交感前神經(jīng)元m EPSC無(wú)顯著影響,提示orexin A對(duì)交感前神經(jīng)元興奮作用與突觸前興奮性電流變化無(wú)關(guān)。而orexin A對(duì)大鼠PVN交感前神經(jīng)元NSCC影響結(jié)果顯示,orexin A可顯著增大兩組大鼠PVN交感前神經(jīng)元NSCC,經(jīng)電流電壓擬合后,NSCC呈現(xiàn)非電壓依賴(lài)性,并且NSCC的增強(qiáng)在OZRs顯著大于LZRs。結(jié)果表明,orexin A增強(qiáng)OZRs PVN交感前神經(jīng)元的興奮作用,主要與增強(qiáng)突觸后NSCC有關(guān)。小結(jié):orexin A可通過(guò)激活OXR1而非OXR2,顯著增強(qiáng)OZRs PVN交感前神經(jīng)元興奮性,此作用與orexin A增強(qiáng)突觸后非選擇性陽(yáng)離子電流有關(guān)。第三部分:下調(diào)室旁核饑餓素1型受體對(duì)肥胖Zucker大鼠高血壓的改善作用目的:觀察下調(diào)下丘腦PVN饑餓素受體1對(duì)肥胖Zucker大鼠動(dòng)脈血壓的影響及其機(jī)制。方法:成年肥胖Zucker大鼠隨機(jī)分為三組:OZRs、OXR1-SHR、OXR1-SCR,其中OXR1-SHR接受PVNOXR1-sh RNA微量注射,OXR1-SCR接受PVNnon-functional RNA微量注射。采用干擾RNA技術(shù)降低下丘腦PVN中OXR1表達(dá),并同時(shí)采用無(wú)線(xiàn)遙測(cè)植入技術(shù)連續(xù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)動(dòng)物42天OXR1下調(diào)過(guò)程中動(dòng)脈血壓的變化。采用Labchart軟件提取脈搏間期,進(jìn)而分析心率變異度(heart rate variability,HRV),包括極低頻VLF、低頻LF以及高頻HF,LF/HF用于反應(yīng)交感神經(jīng)活性的變化;應(yīng)用western blot比較OXR1蛋白表達(dá)變化以明確OXR1下調(diào);在體PVN分別給予orexin以及OXR1受體阻斷劑,觀察MAP、HR以及RSNA的變化;應(yīng)用全細(xì)胞電流鉗方法觀察OXR1下調(diào)對(duì)PVN交感前神經(jīng)元興奮性的影響。結(jié)果:基礎(chǔ)狀態(tài)下三組大鼠的MAP和HR相互之間無(wú)顯著差異。PVN注射OXR1-sh RNA1后23天,OXR1-SHR組大鼠MAP開(kāi)始逐漸下降,到第26天其MAP顯著低于OZRs以及OXR1-SCR組大鼠。心率變異度分析發(fā)現(xiàn),雖然三組大鼠之間總頻譜能量沒(méi)有差異,但OXR1-SHR組大鼠LF/HF比值顯著低于其余兩組大鼠。同時(shí),42天后,OXR1-SHR組大鼠PVN中OXR1受體含量顯著低于其余兩組大鼠,而后兩組動(dòng)物之間無(wú)顯著差異。整體功能學(xué)研究結(jié)果顯示,PVN給予OXR1受體選擇性阻斷劑SB334867可顯著降低OZRs以及OXR1-SCR組大鼠MAP、HR和RSNA,但是對(duì)OXR1-SHR組大鼠血流動(dòng)力學(xué)無(wú)顯著影響;同時(shí)OXR1-SHR組大鼠對(duì)PVN注射orexin A引起的升壓效應(yīng)顯著低于OZRs和OXR1-SCR組大鼠。全細(xì)胞電流鉗研究結(jié)果顯示,OXR1-SHR組大鼠PVN逆行標(biāo)記的交感前神經(jīng)元放電頻率顯著低于其余兩組大鼠,并且orexin A引起的興奮效應(yīng)明顯減弱。綜上所述,OXR1-sh RNA可顯著降低OZRs大鼠PVN中OXR1表達(dá),降低其興奮性,改善交感活性增強(qiáng),降低動(dòng)脈血壓。小結(jié):降低肥胖Zucker大鼠PVN中OXR1表達(dá)可通過(guò)抑制PVN交感前神經(jīng)元興奮性、降低外周交感神經(jīng)活性,進(jìn)而改善肥胖Zucker大鼠高血壓。結(jié)論:OZRs下丘腦PVN中OXR1受體表達(dá)上調(diào)通過(guò)增強(qiáng)突觸后非選擇性陽(yáng)離子通道電流,提高下丘腦PVN交感前神經(jīng)元興奮性,使外周交感神經(jīng)傳出活動(dòng)增多,導(dǎo)致心率加快、血壓升高;相反,通過(guò)OXR1-sh RNA下調(diào)OZRs下丘腦PVN中OXR1表達(dá)可顯著降低交感前神經(jīng)元興奮性,進(jìn)而引起外周交感傳出活動(dòng)降低,導(dǎo)致心率減慢、血壓降低。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R589.2

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本文編號(hào)：1582489