發(fā)布時間：2018-03-07 16:43

  本文選題：腺相關(guān)病毒　切入點：micro　出處：《河北醫(yī)科大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的:肌萎縮側(cè)索硬化(Amyotrophic Lateral Sclerosis,ALS)是一種致死性的慢性進行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病,以選擇性侵犯上、下運動神經(jīng)元為特征,主要累及大腦皮層運動神經(jīng)元、腦干運動神經(jīng)核團、脊髓前角運動神經(jīng)元,臨床表現(xiàn)為骨骼肌的進行性萎縮。其中約90%為散發(fā)性肌萎縮側(cè)索硬化(sporadic Amyotrophic Lateral Sclerosis,s ALS),其余為家族性肌萎縮側(cè)索硬化癥(familial Amyotrophic Lateral Sclerosis,f ALS)。絕大多數(shù)患者通常在診斷后3-5年內(nèi)死亡,目前尚無有效的治療方法。迄今為止,ALS的病因尚未完全明確。其中,突變的超氧化物歧化酶(mutant Superoxide Dismutase 1,m SOD1)是ALS首個被發(fā)現(xiàn)的致病基因,也是f ALS患者中目前發(fā)現(xiàn)的主要突變基因(約占20%)。雖然m SOD1確切的致病機制仍處于探索之中,但是針對m SOD1的基因治療已在不斷深入。目前多項研究證明腺相關(guān)病毒(Adeno-associated virus,AAV)介導的基因療法可通過敲降m SOD1有效地延長SOD1-G93A小鼠的生存期,這為ALS的治療提供了新途徑。由于高效、廣泛的中樞神經(jīng)系統(tǒng)基因轉(zhuǎn)導是基因治療的關(guān)鍵,因此,與載體轉(zhuǎn)導和表達密切相關(guān)的AAV血清型和注射方式的選擇顯得尤為重要。為進一步探索micro RNA的治療效果及更優(yōu)化的基因傳遞方法,我們在之前建立的簡易、客觀、可評估的鞘內(nèi)(intrathecal,IT)注射的基礎(chǔ)上,探究了注射速度對AAV在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)轉(zhuǎn)導效率的影響,進一步確定了在相對高效、精準的操作下AAV介導的micro RNA對SOD1-G93A小鼠的治療效果。方法:1鞘內(nèi)注射及實驗分組1.1鞘內(nèi)注射我們通過直接腰椎穿刺的方法給SOD1-G93A小鼠(30d)鞘內(nèi)注射8ul含有1%利多卡因鹽酸鹽的r AAVrh.10-GFP-ami R-SOD1(3×1012GC/ml)和磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS),且分別采用不同的注射速度:8分鐘內(nèi)注射完畢(8μl/8min)和30秒內(nèi)注射完畢(8μl/30s)。鞘內(nèi)(IT)注射的評價標準為:0分-肢體無癱瘓;1分-后肢輕癱;2分-后肢未完全癱瘓伴明顯步態(tài)異常或者僅單側(cè)后肢完全癱瘓;3分-雙后肢完全癱瘓;4分-雙后肢完全癱瘓、呼吸急促伴雙上肢輕癱;5分-四肢完全癱瘓伴呼吸急促。其中,IT注射評分≥4分者視為注射成功。1.2實驗分組雌性、雄性SOD1-G93A小鼠(30d),各分為三組:低速注射組(r AAVrh.10-GFP-ami R-SOD1,8μl/8min),快速注射組(r AAVrh.10-GFPami R-SOD1,8μl/30s),對照組(PBS,8μl/8min或8μl/30s)。2行為學觀察及體重測量各組SOD1-G93A小鼠從30d即注射后開始,90d前測量體重1次/1周,后2次/周,測量盡量在同一時間段內(nèi)進行。低速注射組與對照組分別在110d、120d、130d量取后肢步長。嚴密觀察,妥善飼養(yǎng),記錄發(fā)病日期與終末日期。因體重的客觀性,本實驗以體重達峰值后連續(xù)兩次下降的第二次降低時間為評價發(fā)病與否的主要標準,并結(jié)合其后肢活動情況。終末的判斷標準為:將小鼠側(cè)翻后30s內(nèi)不能翻身。3組織處理與免疫染色3.1組織處理取各組SOD1-G93A小鼠鞘注后6w、發(fā)病早期(約120d)、終末期(135-144d)各3-4只,麻醉后經(jīng)PBS處理,4%多聚甲醛固定24h后的腦與脊髓組織經(jīng)30%蔗糖4℃過夜脫水后用OCT包埋組織,使用冰凍切片機切成厚25μm切片;取腰4或腰5脊神經(jīng)根于0.01M PBS溶液內(nèi)4℃保存。另外,每組取3-4只發(fā)病早期(約120d)小鼠經(jīng)2.5%戊二醛固定后取腰4或腰5脊神經(jīng)根于4%戊二醛溶液內(nèi)4℃保存用于半薄切片、甲苯胺藍染色。3.2免疫組織化學染色脊髓切片經(jīng)過1%H2O2處理后于PBS內(nèi)漂洗,血清封閉(PBS+5%羊血清+0.3%Triton X-100)后,一抗孵育4℃過夜,其中6w和終末期的脊髓片分別加入抗GFP抗體,120d左右的脊髓片孵育抗Neu N、抗GFAP抗Iba1抗體。經(jīng)PBS漂洗后孵育二抗、三抗后,DAB顯色,后經(jīng)撈片、脫水、透明及封片,Olympus BX51顯微鏡觀察及記錄。對于神經(jīng)元計數(shù),脊髓前角直徑大于20um的多突起有核神經(jīng)元視為運動神經(jīng)元。3.3免疫熒光染色脊髓切片或整個神經(jīng)根,經(jīng)漂洗、穿孔、封閉,選擇相應一抗(抗GFP、抗Neu N、抗GFAP、抗Iba1、抗APC和抗h SOD1抗體)孵育過夜后經(jīng)熒光二抗孵育并再次PBS漂洗后,DAPI封片,使用Olympus FV1000激光共聚焦顯微鏡進行觀察及照相。3.4甲苯胺藍染色三組脊神經(jīng)前根(約120d)經(jīng)磷酸鹽緩沖液漂洗后,鋨酸固定,丙酮脫水后,樹脂包埋,切成厚1μm的半薄切片,貼片,烤干,甲苯胺藍染色后沖洗,Olympus BX51顯微鏡觀察及記錄。對于神經(jīng)根軸索計數(shù),髓鞘淡染均勻者視為正常軸索,反之視為異常。4蛋白印跡終末期小鼠(140d-147d)經(jīng)麻醉后,取其皮層、腰髓,液氮速凍后,-80℃保存?zhèn)溆?后提取組織總蛋白,采用BCA法測定蛋白濃度。蛋白上樣量為50μg,經(jīng)SDS-PAGE電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜,脫脂奶粉封閉后,一抗(抗GFP、抗GAPDH)4℃搖床孵育過夜。次日漂洗后經(jīng)熒光二抗孵育,再次漂洗后經(jīng)Odyssey紅外掃描成像系統(tǒng)掃膜,分析結(jié)果。5統(tǒng)計分析計量資料用x±SEM表示,采用SPSS 18.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理。發(fā)病時間和生存期采用Kaplan Meier分析,兩組之間的比較用兩獨立樣本t檢驗,多組之間的比較用One-way ANOVA分析,StudentNewman-Keuls test兩兩分析。P0.05為有顯著差異,有統(tǒng)計學意義。結(jié)果:1 r AAVrh.10經(jīng)鞘內(nèi)注射后在SOD1-G93A小鼠整個脊髓中持續(xù)表達,且較低的注射速度下r AAVrh.10的表達效率更高。2快速鞘內(nèi)注射r AAVrh.10-GFP-ami R-SOD1在大腦的轉(zhuǎn)導效率較高。3低速鞘內(nèi)注射r AAVrh.10-GFP-ami R-SOD1對在脊髓神經(jīng)根表達較高且對脊神經(jīng)前根有更好地保護作用。4低速鞘內(nèi)注射r AAVrh.10-GFP-ami R-SOD1可使SOD1-G93A小鼠推遲發(fā)病并延長生存期。5 r AAVrh.10-GFP-ami R-SOD1可轉(zhuǎn)導神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞,并可在體內(nèi)敲降m SOD1。6低速鞘內(nèi)注射r AAVrh.10-GFP-ami R-SOD1可緩解SOD1-G93A小鼠腰髓前角的膠質(zhì)細胞增生并保護運動神經(jīng)元。結(jié)論:鞘內(nèi)注射r AAVrh.10-GFP-ami R-SOD1可實現(xiàn)在ALS小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的持續(xù)廣泛轉(zhuǎn)導,且有確切的治療作用。另外,注射速度影響AAV的轉(zhuǎn)導模式和治療效果,表明注射時瞬時升高的CSF壓力在AAV載體的擴散中發(fā)揮著重要作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R744.8;R-332

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本文編號：1580105