本文選題：氯胺酮　切入點：原代培養(yǎng)皮層神經元　出處：《河北醫(yī)科大學》2014年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：全世界每年有150萬嬰幼兒因需進行外科手術或介入治療等原因而接受全身麻醉，長期以來全身麻醉藥是否影響嬰幼兒的大腦發(fā)育一直是患兒家屬及麻醉學者十分關注的問題。傳統(tǒng)觀念認為只要麻醉過程中不存在大腦缺氧等因素就不會影響嬰幼兒大腦的發(fā)育，但近年來大量的動物實驗研究表明全身麻醉藥可對發(fā)育期大腦產生損傷，并引起遠期學習記憶損傷。因此全身麻醉藥的發(fā)育期神經毒性已引起了眾多學者的關注。 氯胺酮為N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate, NMDA)受體拮抗劑，被廣泛應用于嬰幼兒手術的麻醉。NMDA受體是一種離子通道型谷氨酸能受體，具有許多不同變構調控位點并對Ca2+高度通透，在中樞神經系統(tǒng)主要分布在大腦皮層及海馬。研究發(fā)現(xiàn)NMDA受體與中樞神經系統(tǒng)的發(fā)育密切相關，控制神經元的分化、遷移和存活，并在學習、記憶的形成和維持過程中發(fā)揮著重要作用。動物出生前后時間階段是中樞神經系統(tǒng)生長發(fā)育的高峰期，有大量神經細胞增殖、大量樹突生成和大量突觸連接形成，進而形成復雜的神經網絡。許多研究已證實在大腦發(fā)育的關鍵時期NMDA受體保持適度興奮對大腦神經元的存活具有重要的意義，如果改變NMDA受體的活性可能會影響中樞神經系統(tǒng)的發(fā)育和功能。 目前大量研究發(fā)現(xiàn)氯胺酮可引起發(fā)育期動物大腦廣泛腦區(qū)神經元的凋亡，同時也發(fā)現(xiàn)氯胺酮可引起原代培養(yǎng)皮層神經元的大量凋亡。關于氯胺酮引起發(fā)育期大腦神經元凋亡與神經功能損害的確切機制目前還不清楚。既往研究表明在大鼠大腦快速發(fā)育期注射氯胺酮會導致皮層組織的NMDA受體表達上調，引起神經元興奮性毒性增加。此外，氯胺酮作為NMDA受體的非競爭性拮抗劑，可以通過作用于NMDA受體PCP結合位點，阻斷與NMDA受體耦聯(lián)的鈣通道，減少Ca2+內流，降低細胞內Ca2+濃度，從而拮抗谷氨酸、天冬氨酸等興奮性氨基酸對神經系統(tǒng)發(fā)育的調節(jié)。目前有研究認為氯胺酮通過抑制神經元細胞內鈣震蕩而對發(fā)育期神經元產生神經毒性。 針對全身麻醉藥引起的發(fā)育期大腦損傷，NIH、FDA以及IARS要求研究學者不僅要研究其發(fā)生機制而且要尋找安全有效的措施來防治麻醉藥所引起的發(fā)育期大腦損傷。近年來國內外學者對如何防治氯胺酮引起的發(fā)育期大腦損傷進行了一系列研究，結果表明維生素D3、鋰劑、促紅細胞生成素、肉毒堿、煙酰胺、可樂定等可對氯胺酮引起的發(fā)育期神經元損傷產生保護作用，但它們在嬰幼兒時期應用的安全性還有待于進一步研究。 神經甾體（neurosteroid）是一類由神經系統(tǒng)的神經元或神經膠質細胞合成、代謝產生的具有神經活性的甾體物質的總稱，主要包括：孕烯醇酮（pregnenolone，PREG）、孕烯醇酮硫酸酯（pregnenolone sulfate，PREGS）、脫氫表雄酮（dehydroepiandrosterone，DHEA）、脫氫表雄酮硫酸酯（dehydroepiandrosterone sulfate，DHEAS）、孕酮（progesterone，PROG）、別孕烯醇酮（allopregnanolone，AP）以及雌二醇（estradiol，E2）等。大量研究表明神經甾體不僅參與調節(jié)神經系統(tǒng)的發(fā)育并對神經系統(tǒng)的功能產生廣泛影響，對神經系統(tǒng)還具有營養(yǎng)保護以及促進神經發(fā)生和神經元存活的作用。 雌二醇作為一種內源性神經甾體，在神經元發(fā)育過程中發(fā)揮重要的調節(jié)作用，促進神經元的存活以及功能維護。最近有研究表明氯胺酮可引起斑馬魚發(fā)育期17β雌二醇水平的下降，睪酮水平升高，同時還有研究表明氯胺酮對發(fā)育期斑馬魚具有神經損傷作用。PI3K-Akt信號通路是介導多種生長因子促進細胞存活的重要通路，有研究表明氯胺酮通過抑制NMDA受體的活性進而抑制pAkt的表達對原代培養(yǎng)的皮層神經元產生損傷。有研究表明17β雌二醇可通過激活PI3K-Akt信號通路對NMDA受體拮抗劑MK-801以及麻醉藥咪達唑侖、笑氣、異氟醚聯(lián)合應用所引起的發(fā)育期大鼠大腦廣泛腦區(qū)神經元凋亡產生保護作用。另外Ramezani等研究表明17β雌二醇可對酒精引起的發(fā)育期大鼠大腦神經損傷以及遠期行為學異常產生保護作用。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)Aβ25-35對原代培養(yǎng)皮層神經元產生損傷時伴隨神經甾體代謝通路的變化。氯胺酮引起發(fā)育期皮層神經元損傷的同時是否伴隨神經甾體合成代謝的變化，以及神經活性甾體17β雌二醇是否通過PI3K-Akt信號通路對氯胺酮引起的皮層神經元損傷產生保護作用，國內外未見報道。 本課題首先以原代培養(yǎng)的大鼠皮層神經元為研究對象采用不同濃度的氯胺酮建立氯胺酮體外誘導皮層神經元損傷的細胞模型。在該模型的基礎上采用液液萃取結合高效液相色譜-質譜聯(lián)用（HPLC-MS/MS）方法對氯胺酮引起皮層神經元損傷時主要神經甾體PREG、PROG以及17β雌二醇合成代謝水平進行了研究。隨后以氯胺酮損傷皮層神經元時合成代謝水平明顯降低的17β雌二醇進行外源性給藥，從離體細胞和在體動物兩方面研究17β雌二醇對氯胺酮誘導的原代培養(yǎng)皮層神經元損傷以及發(fā)育期大鼠皮層區(qū)神經細胞損傷的保護作用。最后應用原代培養(yǎng)皮層神經元進一步研究17β雌二醇是否通過PI3K-Akt信號通路保護發(fā)育期皮層神經元免受氯胺酮的損傷。本實驗將為神經活性甾體17β雌二醇防治氯胺酮引起的發(fā)育期大腦損傷提供理論依據(jù)及實驗基礎。 本研究采用的試驗方法包括： 1大鼠大腦皮層神經元的原代培養(yǎng) 大鼠大腦皮層神經元進行原代培養(yǎng)7天用于實驗。倒置顯微鏡下觀察皮層神經元的形態(tài)學變化。 2分組與藥物處理 ①觀察氯胺酮對神經元的損傷作用時分為：不同濃度氯胺酮（0、1、10、100、1000μΜ）作用神經元24h100μΜ氯胺酮作用神經元不同時間（0、6、12、24、48h） ②觀察氯胺酮對神經元神經甾體合成的影響分為：對照組、氯胺酮組、膽固醇組、氯胺酮+膽固醇組 ③觀察17β雌二醇對氯胺酮誘導皮層神經元凋亡的影響分為：對照組，氯胺酮組，17β雌二醇+氯胺酮組 ④觀察17β雌二醇對氯胺酮引起發(fā)育期大鼠大腦皮層區(qū)神經細胞凋亡和遠期學習記憶損傷的影響分為：對照組，溶劑對照組，17β雌二醇組，氯胺酮組，17β雌二醇+氯胺酮組 ⑤研究17β雌二醇保護原代培養(yǎng)皮層神經元免受氯胺酮損傷的機制分為： 對照組，氯胺酮組，17β雌二醇+氯胺酮組，17β雌二醇+氯胺酮+LY294002組 3細胞樣品的收集與蛋白定量 給予各種藥物處理的皮層神經元，加入細胞裂解液，低溫離心收集上清，應用多功能酶標儀測定蛋白質濃度。 4MTT法測定皮層神經元的存活率 5Hoechst33258核染色法檢測神經元凋亡 在熒光顯微鏡下，隨機選取5個視野進行形態(tài)學觀察和計數(shù)，計算凋亡率，凋亡率=（凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù)）×100%。 6TUNEL法檢測原代培養(yǎng)皮層神經元凋亡 細胞爬片于倒置顯微鏡下任意選取5個視野觀察陽性細胞并計數(shù)，計算神經元的凋亡率，凋亡率=（凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù)）×100%。 7免疫組織化學染色分析大腦皮層區(qū)cleaved-caspase-3表達： 以細胞中出現(xiàn)棕褐色濃染顆粒作為陽性細胞的判定標準。在光鏡下觀察皮層區(qū)的凋亡神經細胞，以個/0.01mm2計數(shù)。 8Western-blot法檢測p-Akt、Akt、cleaved-caspase-3、Bcl-2的蛋白表達 9HPLC-MS/MS測定細胞培養(yǎng)液中主要神經甾體的濃度 10Morris水迷宮行為學測試 11統(tǒng)計學處理 各組數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差（±s）表示，應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行處理，水迷宮行為學測試中定位航行實驗數(shù)據(jù)采用重復測量方差分析進行統(tǒng)計學處理，其他數(shù)據(jù)采用單因素方差分析（one way ANOVA）繼以LSD post hoc test進行統(tǒng)計學處理,以P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。 結果： 1氯胺酮對原代培養(yǎng)皮層神經元的損傷作用 1.1氯胺酮呈濃度和時間依賴性降低原代培養(yǎng)皮層神經元存活率 不同濃度的氯胺酮作用于體外培養(yǎng)7天的皮層神經元24h后，神經元存活率下降，其中100、1000μΜ的氯胺酮使神經元存活率顯著下降（P0.01，P0.01）。100μΜ氯胺酮作用于神經元不同時間后神經元存活率下降，其中作用24h及48h后，神經元存活率顯著下降（P0.05，P0.01）。 1.2氯胺酮損傷大鼠皮層神經元時的細胞形態(tài)變化 倒置顯微鏡下觀察剛種植的皮層神經元呈圓形，單個均勻分布，折光性強，胞體透亮，接種8h后細胞貼壁，24h后細胞貼壁牢固并可見短小的突起，胞體呈梭型或雛形，第三天后神經元胞體進一步增大，部分細胞突起延長，神經元培養(yǎng)至第7天，胞體進一步增大，多呈梭型或雛形，胞體飽滿，部分神經元集聚成團，突起增多并延長，相互交織形成網絡。培養(yǎng)7天的神經元經100μΜ氯胺酮處理24h后，神經元細胞數(shù)量較對照組明顯減少，折光性差，胞體明顯縮小，軸突斷裂，部分神經元細胞膜破裂成細胞碎片。 1.3氯胺酮對原代培養(yǎng)皮層神經元凋亡的影響 TUNEL結果顯示，對照組僅見少量的TUNEL陽性神經元，100μΜ氯胺酮組TUNEL陽性神經元較對照組顯著增加（P0.01）。Hoechst33258熒光染色結果顯示，對照組細胞核內呈均勻分布的淡藍色熒光，內有較深的藍色顆粒，有少量凋亡細胞呈亮藍色。100μΜ氯胺酮組皮層神經元染色質高度凝聚、邊緣化，細胞核甚至裂解為碎塊，有大量凋亡細胞呈亮藍色(P0.01)。 2氯胺酮對原代培養(yǎng)皮層神經元神經甾體水平的影響 2.1不同處理對皮層神經元存活率的影響 MTT結果顯示，與對照組比較，氯胺酮組皮層神經元的存活率顯著下降（P0.01），膽固醇單純處理組神經元存活率未見顯著改變（P0.05）。與氯胺酮組比較，膽固醇與氯胺酮共處理組神經元存活率顯著升高（P0.01）。 2.2不同處理對神經元凋亡的影響 TUNEL結果顯示，與對照組比較，膽固醇單純處理組TUNEL陽性神經元未見顯著變化（P＞0.05），氯胺酮組TUNEL陽性神經元顯著增加（P0.01）。與氯胺酮比較，膽固醇與氯胺酮共處理組TUNEL陽性神經元顯著降低（P0.01）；Hoechst33258熒光染色結果進一步證實了以上變化。 2.3氯胺酮對皮層神經元神經甾體水平的影響 對照組及氯胺酮處理組因未加入神經甾體合成所必需的底物膽固醇，均未測得各種神經甾體。與膽固醇單純處理組相比，氯胺酮共處理后神經甾體PREG水平未見顯著變化，而17β雌二醇水平顯著下降(P0.01)，PROG水平顯著升高（P＞0.05）。 317β雌二醇對氯胺酮誘導的發(fā)育期皮層神經元凋亡以及發(fā)育期大鼠遠期學習記憶損傷的影響 3.117β雌二醇對氯胺酮導致的原代培養(yǎng)皮層神經元損傷的影響 MTT結果顯示，與對照組比較,氯胺酮組原代培養(yǎng)皮層神經元存活率顯著下降（P0.01）；與氯胺酮組比較，不同濃度（0.001、0.01、0.1、1μΜ）的17β雌二醇與氯胺酮共處理24h后神經元的存活率顯著升高，其存活率分別為(54.8±5.1)%，(75.1±9.3)%，(88.3±8.5)%，(79.5±10.3)%，其中0.1μM的17β雌二醇保護效果最好。 3.217β雌二醇減輕氯胺酮誘導的原代培養(yǎng)皮層神經元凋亡 TUNEL結果顯示，對照組可見少量的凋亡神經元，氯胺酮組神經元凋亡較對照組顯著增加（P0.01），0.1μM的17β雌二醇使氯胺酮導致的神經元凋亡顯著降低（P0.01）。Hoechst33258核染色法進一步證實了17β雌二醇減輕氯胺酮誘導的皮層神經元凋亡。對照組細胞核多呈彌散均勻分布的淡藍色熒光，內有較深的藍色顆粒，，有少量的凋亡細胞呈亮藍色。氯胺酮組凋亡細胞較對照組顯著增加(P0.01)，17β雌二醇與氯胺酮共處理組神經元凋亡較氯胺酮組顯著降低（P0.01）。 3.3不同處理對發(fā)育期大鼠大腦額葉皮層區(qū)cleaved-caspase-3表達的影響 與對照組比較，溶劑對照組和17β雌二醇組cleaved-caspase-3陽性表達細胞數(shù)/0.01mm2未見統(tǒng)計學差異（均為P0.05），氯胺酮組陽性表達顯著增加（P0.01）。與氯胺酮組比較，17β雌二醇與氯胺酮共處理組陽性表達顯著降低（P0.01）。 3.4Morris水迷宮測試SD大鼠學習記憶能力 SD幼鼠飼養(yǎng)至60天時，進行Morris水迷宮5天訓練，一天四次。把SD大鼠逃逸潛伏期（s）和游泳距離（cm）作為學習能力的指標。在5天的訓練期中，前2天實驗各組逃逸潛伏期和游泳距離未見統(tǒng)計學差異。與對照組比較，氯胺酮組第3天、第4天、第5天逃逸潛伏期和游泳距離均顯著增加（均為P0.01），與氯胺酮組比較，17β雌二醇與氯胺酮共處理組逃逸潛伏期和游泳距離均顯著降低（均為P0.01）；第6天撤去平臺，進行60s空間探索試驗作為對記憶能力的評估。與對照組比較，氯胺酮組穿越平臺的次數(shù)和靶象限的時間比率均顯著減少（均為P0.01），與氯胺酮組比較，17β雌二醇與氯胺酮共處理組穿越平臺的次數(shù)和靶象限的時間比率均顯著增加（均為P0.01）。 417β雌二醇保護原代培養(yǎng)皮層神經元免受氯胺酮損傷的機制研究 4.1不同處理對原代培養(yǎng)皮層神經元pAkt表達水平的影響 結果顯示，與0h相比，0.1μM的17β雌二醇單獨處理皮層神經元0.5、1、2、4h, pAkt表達水平時間依賴性顯著升高（P0.01）；17β雌二醇與氯胺酮共處理皮層神經元0.5、1、2、4h， pAkt表達水平隨時間延長顯著升高（P0.01）。為了進一步證實17β雌二醇通過PI3K-Akt信號通路對氯胺酮引起的皮層神經元損傷產生保護作用。給予PI3K抑制劑LY294002，觀察對皮層神經元pAkt表達水平的影響。與對照組比較，17β雌二醇培養(yǎng)皮層神經元2h引起pAkt表達水平的顯著升高（P0.01）,氯胺酮培養(yǎng)皮層神經元2h引起pAkt表達水平的顯著降低（P0.01）。與氯胺酮組比較，17β雌二醇與氯胺酮共培養(yǎng)2h pAkt表達水平顯著升高（P0.01），加入PI3K抑制劑LY294002后培養(yǎng)2h，LY294002抑制了17β雌二醇對pAkt表達水平的上調作用（P0.01）。 4.217β雌二醇對原代培養(yǎng)皮層神經元Bcl-2表達水平的影響 Bcl-2作為一種抗凋亡分子，對多種損傷產生保護作用。Akt可通過激活CREB磷酸化，提高Bcl-2的表達水平，從而對各種應激提供神經保護作用。為了探討17β雌二醇是否有可能通過PI3K-Akt信號通路影響B(tài)cl-2的表達水平對氯胺酮引起的神經元損傷產生保護作用，我們將皮層神經元給予100μM氯胺酮和（或）0.1μM的17β雌二醇以及10μMLY294002處理24h，結果顯示與對照組比較，氯胺酮組Bcl-2表達水平顯著下降（P0.01）；與氯胺酮組比較，17β雌二醇與氯胺酮共處理組Bcl-2表達水平顯著增加（P0.01）；與17β雌二醇與氯胺酮共處理組比較，LY294002預處理組Bcl-2表達水平顯著下降（P0.01）。 4.317β雌二醇對原代培養(yǎng)皮層神經元cleaved-caspase-3表達水平的影響 Caspase-3是各種細胞凋亡通路的最終執(zhí)行者。為了探討17β雌二醇是否有可能通過PI3K-Akt信號通路影響cleaved-caspase-3的表達水平對氯胺酮引起的神經元損傷產生保護作用，我們將皮層神經元給予100μM氯胺酮和（或）0.1μM的17β雌二醇以及10μM LY294002處理24h，結果顯示與對照組比較，氯胺酮組cleaved-caspase-3表達水平顯著增加（P0.01）；與氯胺酮組比較，17β雌二醇與氯胺酮共處理組cleaved-caspase-3表達水平顯著下降（P0.01）；與17β雌二醇與氯胺酮共處理組比較，LY294002預處理組cleaved-caspase-3表達水平顯著增加（P0.01）。 4.4LY294002對17β雌二醇神經保護作用的影響 MTT結果顯示,與對照組比較，氯胺酮組皮層神經元存活率顯著降低（P0.01），與氯胺酮組比較，17β雌二醇與氯胺酮共處理組神經元存活率顯著增加（P0.01），與17β雌二醇與氯胺酮共處理組比較，LY294002預處理組皮層神經元存活率顯著降低（P0.01）。TUNEL結果顯示對照組可見少量的凋亡神經元，與對照組比較，氯胺酮組神經元凋亡顯著增加（P0.01），與氯胺酮組比較，17β雌二醇與氯胺酮共處理組神經元凋亡顯著降低（P0.01），與17β雌二醇與氯胺酮共處理組比較，LY294002預處理組神經元凋亡顯著增加（P0.01）。Hoechst33258核染色法進一步證實了TUNEL試驗所見。 結論： 1氯胺酮能濃度和時間依賴性的引起原代培養(yǎng)皮層神經元損傷。 2氯胺酮在導致原代培養(yǎng)皮層神經元損傷的同時伴隨某些神經甾體水平的變化，其中PROG水平顯著升高，17β雌二醇水平顯著降低。 317β雌二醇對氯胺酮引起的原代培養(yǎng)皮層神經元損傷具有保護作用。 4外源系統(tǒng)性給予17β雌二醇對氯胺酮引起的發(fā)育期大鼠皮層區(qū)神經細胞凋亡以及成年后學習記憶損傷產生保護作用。 5激活PI3K-Akt信號通路，促進抗凋亡分子Bcl-2的表達，抑制促凋亡分子cleaved-caspase-3的表達可能是17β雌二醇對氯胺酮引起的皮層神經元損傷產生保護作用的機制之一。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R614

【參考文獻】

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本文編號：1570005