本文選題：腹主動(dòng)脈瘤　切入點(diǎn)：普伐他汀　出處：《山東大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：1研究背景腹主動(dòng)脈瘤(abdominal aortic aneurysm,AAA)是一種常見的具有潛在致死危險(xiǎn)的慢性血管退行性疾病,一旦破裂,死亡率超過85%。在美國,AAA在65歲以上的男性老年人群中發(fā)病率達(dá)到6%-9%,而每年因AAA破裂導(dǎo)致死亡的人數(shù)占總死亡人數(shù)的0.8%。目前由于對(duì)AAA缺乏有效的內(nèi)科治療手段,臨床上一旦發(fā)現(xiàn)AAA,即采用危險(xiǎn)性很高的手術(shù)治療切除AAA,以預(yù)防瘤體的破裂而致命。由于AAA具備危害性大、內(nèi)科治療效果差及外科手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)高等臨床特征,因此從AAA的發(fā)病機(jī)制著手,找到致AAA的危險(xiǎn)因素,進(jìn)而預(yù)防AAA的形成和破裂,具有重要意義。機(jī)制上,AAA是由于動(dòng)脈中層彈力蛋白破壞、血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)凋亡、代償性膠原蛋白沉積等而引起腹主動(dòng)脈管壁的永久性擴(kuò)張。血管壁的炎癥反應(yīng)和基質(zhì)降解是引起AAA的關(guān)鍵因素。例如,在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中,血管緊張素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ,AngⅡ)能上調(diào)氧化應(yīng)激,從而啟動(dòng)基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)的基因轉(zhuǎn)錄,最終導(dǎo)致AAA形成。他汀類藥物(3-羥基-3-甲基戊二酰單酰輔酶A還原酶抑制劑)除了具有強(qiáng)效降脂作用外,還能通過抑制VSMC增殖、阻止內(nèi)皮細(xì)胞黏附、改善內(nèi)皮功能以阻止動(dòng)脈粥樣硬化的形成。他汀類藥物也可引起不良作用,例如胰島素抵抗、肝酶升高、骨骼肌毒性和心肌萎縮。然而,現(xiàn)有的研究結(jié)果中他汀類藥物對(duì)AAA的作用尚存在分歧。例如,普伐他汀在低劑量(5mg/kg/day)時(shí)可以抑制腦動(dòng)脈瘤的形成,而在高劑量(25mg/kg/day和50mg/kg/day)時(shí)則促進(jìn)雌激素敲除大鼠腦動(dòng)脈瘤的形成。與之不同的是,辛伐他汀抑制了 AngⅡ所誘導(dǎo)的載脂蛋白E基因敲除(Apoe-/-)小鼠AAA的形成;瑞舒伐他汀和阿托伐他汀對(duì)AAA無影響。AMP 活化的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)在真核生物能量穩(wěn)態(tài)中起重要作用,它含有α、β、γ三種亞單位,其中αα是催化亞單位,β和γ是調(diào)節(jié)亞單位。前期研究發(fā)現(xiàn)吸煙的主要活性成分尼古丁可激活A(yù)MPK,最終導(dǎo)致了 Apoe-/-小鼠AAA形成;普伐他汀在骨骼肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞能激活A(yù)MPK,提示普伐他汀可能促進(jìn)AAA形成。激活蛋白2α(Activator protein 2α,AP-2α)是AP-2轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一。研究發(fā)現(xiàn)敲除AP-2轉(zhuǎn)錄因子的小鼠由于異常發(fā)育在出生之后就會(huì)死亡,提示AP-2轉(zhuǎn)錄因子對(duì)哺乳動(dòng)物是必不可少的。Park等人研究認(rèn)為神經(jīng)生長因子能活化轉(zhuǎn)錄因子AP-2α依賴的MMP-2的基因轉(zhuǎn)錄,引起內(nèi)皮細(xì)胞侵潤,最終促進(jìn)血管形成。前期研究發(fā)現(xiàn)AMPKα2作為AP-2α轉(zhuǎn)錄因子的上游激酶,能磷酸化轉(zhuǎn)錄因子AP-2α的第219個(gè)絲氨酸殘基(AP-2α protein at serine 219,AP-2α-S219);阿司匹林可激活A(yù)MPK,從而增加了 AP-2α轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá),最終發(fā)揮穩(wěn)定易損性動(dòng)脈粥樣斑塊的作用。綜上所述,現(xiàn)有的研究結(jié)果中他汀類藥物對(duì)AAA的作用仍然存在分歧,且有關(guān)普伐他汀在AngⅡ所誘導(dǎo)的Apoe-/-小鼠AAA中的作用尚無研究報(bào)道。因此,應(yīng)用AngⅡ誘導(dǎo)的Apoe-/-小鼠的AAA模型,探討普伐他汀對(duì)AAA的影響及機(jī)制研究。2目的(1)觀察普伐他汀在持續(xù)灌注Ang Ⅱ所誘導(dǎo)的Apoe-/-小鼠AAA形成中的作用;(2)探討普伐他汀促進(jìn)AAA形成的分子機(jī)制。3方法3.1構(gòu)建AMPK或者AP-2 α慢病毒載體根據(jù)三個(gè)不同序列的AMPK shRNA或者AP-2α shRNA,轉(zhuǎn)染小鼠VSMCs驗(yàn)證AMPK或者轉(zhuǎn)錄因子AP-2α干擾效果,篩選干擾效果最優(yōu)的shRNA序列構(gòu)建慢病毒載體。3.2動(dòng)物模型的建立體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分為四部分。第一部分:觀察普伐他汀對(duì)Ang Ⅱ所誘導(dǎo)的Apoe--/-小鼠AAA的影響。選取8-12周齡(體重20-25克)雄性Apoe-/-小鼠91只,先用普伐他汀(50mg/kg/day)喂養(yǎng)小鼠4周,然后將生理鹽水或者AngⅡ(0.72mg/kg/day或者1.44mg/kg/day)裝入植入式膠囊滲透壓泵中,將滲透壓泵埋于小鼠皮下持續(xù)恒速泵入28天,并持續(xù)給予普伐他汀。全程給予普通飲食喂養(yǎng)。8周后實(shí)驗(yàn)結(jié)束,小鼠予以安樂死。第二部分和第三部分:應(yīng)用干擾AMPK或者AP-2α的慢病毒探討普伐他汀對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的AAA的作用是否由AMPK或者AP-2α介導(dǎo)。選取8-12周齡(體重20-25克)雄性Apoe-/-小鼠90只,給予普伐他汀(50mg/kg/day)喂養(yǎng)小鼠4周后尾靜脈注射慢病毒,慢病毒注射后第二天,將AngⅡ(1.44mg/kg/day)裝入植入式膠囊滲透壓泵中,然后將滲透壓泵埋于小鼠皮下持續(xù)恒速泵入28天,并持續(xù)給予普伐他汀。全程給予普通飲食喂養(yǎng)。8周后實(shí)驗(yàn)結(jié)束,小鼠予以安樂死。第四部分:觀察辛伐他汀和甲羥戊酸對(duì)Ang Ⅱ所誘導(dǎo)的Apoe--小鼠AAA的影響。選取8-12周齡(體重20-25克)雄性Apoe-/-小鼠77只,先用普伐他汀(50mg/kg/day,口服)、辛伐他汀(50mg/kg/day,灌胃)和甲羥戊酸(2mg/kg/day,腹腔注射)治療小鼠4周,然后將AngⅡ(1.44mg/kg/day)裝入植入式膠囊滲透壓泵中,將滲透壓泵埋于小鼠皮下持續(xù)恒速泵入28天,并持續(xù)給予普伐他汀、辛伐他汀和甲羥戊酸。全程給予普通飲食喂養(yǎng)。8周后實(shí)驗(yàn)結(jié)束,小鼠予以安樂死。3.3組織病理學(xué)檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,小鼠予以安樂死,留取胸主和腹主動(dòng)脈組織,根據(jù)AAA定義(腹主動(dòng)脈最大直徑超過正常腹主動(dòng)脈直徑的50%)觀察AAA的形成率,并測量腹主動(dòng)脈的最大直徑。制備腹主動(dòng)脈石蠟切片,厚度為4.5 μm,進(jìn)行HE染色和Verhoeff彈力纖維染色;免疫組織化學(xué)方法檢測腹主動(dòng)脈組織中α-SM actin、MMP-2、MMP-9、4-HNE和P47的含量;免疫熒光方法用于檢測腹主動(dòng)脈組織中GFP、AMPK和AP-2α的表達(dá)。3.4細(xì)胞培養(yǎng)用4-8代小鼠和人VSMCs進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。(1)小鼠VSMCs應(yīng)用不同濃度(0、0.1、1、10、50、100μM)普伐他汀刺激細(xì)胞2h。(2)小鼠VSMCs用10 μM tempol預(yù)處理30min后,再用50 μM普伐他汀共孵育2h。(3)小鼠VSMCs用20 μM compound C預(yù)處理30min后,再用50 μM普伐他汀共孵育2h。(4)小鼠 VSMCs 轉(zhuǎn)染 Control shRNA 和 AMPK shRNA 或者 AP-2α shRNA干擾AMPK或者AP-2α的表達(dá)后,再用50 μM普伐他汀刺激細(xì)胞24h。(5)小鼠和人VSMCs用50μM普伐他汀預(yù)處理30min后,再用1 mMAngⅡ共孵育24h。(6)小鼠和人VSMCs用50 μM普伐他汀、10 μM辛伐他汀和100 μM甲羥戊酸預(yù)處理30min后,再用1 mM AngⅡ共孵育24h。3.5 活性氧(reactive oxygen species,ROS)的測定利用熒光探針二羥乙錠測定小鼠VSMCs中ROS的水平。3.6 免疫印跡(western blot)利用western blot檢測小鼠腹主動(dòng)脈和VSMCs內(nèi)pAMPK、AMPK、pAP-2α、AP-2α、MMP-2、MMP-9、NOX4、4-HNE和 P47 的蛋白表達(dá)。3.7 RT-PCR從小鼠腹主動(dòng)脈組織或者干預(yù)后的小鼠VSMCs中提取RNA,測定MMP-2和MMP-9的mRNA表達(dá)。β-actin用作為內(nèi)參對(duì)照。3.8明膠酶譜法利用MMP明膠酶譜試劑盒檢測小鼠動(dòng)脈和細(xì)胞培養(yǎng)基中MMP-2的活性。3.9酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)利用ELISA測定人血清中MMP-2的水平。3.10臨床標(biāo)本的收集收集手術(shù)后病人的AAA組織用于病理學(xué)檢測。收集服用普伐他汀后病人的血液,并從血液用提取單核細(xì)胞,提取蛋白,利用western blot檢測pAMPK、AMPK、pAP-2α和AP-2α的表達(dá)。4結(jié)果4.1 Apoe-/-小鼠血壓變化與對(duì)照組相比,AngⅡ輸注后的Apoe-/-小鼠的血壓均顯著升高,然而普伐他汀,甲羥戊酸以及辛伐他汀對(duì)小鼠血壓無明顯影響。4.2 Apoe-/-小鼠血脂的檢測普伐他汀及辛伐他汀治療顯著增加Apoe-/-小鼠內(nèi)TC和LDL-C的水平。4.3普伐他汀增加了 AAA的發(fā)生率、死亡率和嚴(yán)重程度對(duì)照組小鼠未形成AAA及未發(fā)現(xiàn)死亡。AngⅡ(0.72)模型組、AngⅡ(0.72)普伐他汀組、AngⅡ(1.44)模型組和AngⅡ(1.44)普伐他汀組AAA的發(fā)生率為 26.67%、53.33%、60.87%和 91.30%,小鼠死亡率為 0.00%、13.33%、21.74%和47.82%。兩種劑量的AngⅡ均顯著增加了 AAA的發(fā)生率和小鼠的死亡率以及小鼠腹主動(dòng)脈的最大直徑和彈力纖維的將解度,然而持續(xù)灌注劑量為1.44 mg/kg/day的AngⅡ所誘導(dǎo)的AAA的發(fā)生率和小鼠的死亡率以及小鼠腹主動(dòng)脈最大直徑和彈力纖維的降解度比劑量為0.72 mg/kg/day的AngⅡ更加明顯,與模型組相比,普伐他汀顯著增加了小鼠AAA的發(fā)生率、死亡率、嚴(yán)重程度以及腹主動(dòng)脈最大直徑和彈力纖維的降解度。4.4 HE和Verhoff彈力纖維染色模型組AAA可見動(dòng)脈管壁結(jié)構(gòu)破壞,主要表現(xiàn)在部分彈力纖維斷裂、中斷,外膜增厚,動(dòng)脈管壁變薄,呈瘤樣擴(kuò)張,常伴有血栓形成,普伐他汀治療明顯加重了 AngⅡ誘導(dǎo)的AAA動(dòng)脈管壁組織學(xué)的病理變化。4.5普伐他汀在小鼠VSMCs中通過ROS磷酸化ANPK普伐他汀在小鼠VSMCs中呈濃度依賴性的磷酸化AMPK的第172個(gè)蘇氨酸(pAMPK-T172),Tempol可消除普伐他汀上調(diào)Nox4、p47、4-HNE和pAMPK-T172的表達(dá)作用。同樣的,DHE熒光染色表示,Tempol消除了普伐他汀產(chǎn)生的ROS含量。4.6普伐他汀在小鼠VSMCs中通過ROS磷酸化AP-2 α普伐他汀在小鼠VSMCs中呈濃度依賴性的磷酸化AP-2α第219個(gè)絲氨酸(pAP-2α-S219),Tempol可消除普伐他汀上調(diào)pAP-2α-S219的表達(dá)作用。4.7普伐他汀依賴AMPK磷酸化AP-2 αCompound C可消除普伐他汀上調(diào)的pAP-2α-S219的表達(dá)水平。然后應(yīng)用AMPK siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞干擾AMPK的表達(dá)進(jìn)一步觀察AMPK在普伐他汀磷酸化AP-2α中的作用,發(fā)現(xiàn)AMPK siRNA而不是對(duì)照siRNA阻止了普伐他汀對(duì)AP-2α磷酸化的影響。4.8普伐他汀在小鼠VSMCs中通過磷酸化AMPK和AP-2 α上調(diào)MMP2的基因轉(zhuǎn)錄普伐他汀在小鼠VSMCs中呈濃度依賴性的增加MMP-2的蛋白表達(dá),Tempol或者Compound C消除了普伐他汀上調(diào)的MMP-2的蛋白和mRNA表達(dá)水平以及活性。同樣的,用AMPKshRNA干擾細(xì)胞AMPK后,MMP-2的蛋白和mRNA表達(dá)水平以及活性顯著降低。然后用AP-2α siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞干擾AP-2α的表達(dá)后進(jìn)一步觀察AP-2α在普伐他汀上調(diào)MMP-2表達(dá)中的作用。首先,結(jié)果發(fā)現(xiàn)干擾AP-2α后對(duì)普伐他汀磷酸化AMPK無影響,說明AP-2α是AMPK的下游分子。其次,與對(duì)照shRNA+普伐他汀組相比,AP-2α shRNA+普伐他汀組的MMP-2的蛋白和mRNA表達(dá)水平以及活性顯著降低。4.9小鼠VSMCs在AngⅡ刺激狀態(tài)下,普伐他汀能激活A(yù)MPK α 2/AP-2 α/MMP2信號(hào)通路。與對(duì)照組相比,單獨(dú)AngⅡ或者普伐他汀刺激細(xì)胞均能顯著增加pAMPK和pAP-2α的蛋白表達(dá)水平以及MMP-2的蛋白和mRNA表達(dá)水平;而AngⅡ和普伐他汀共孵育進(jìn)一步的增加pAMPK和pAP-2α的蛋白表達(dá)水平以及MMP-2的蛋白和mRNA表達(dá)水平。4.10人VSMCs在AngⅡ刺激狀態(tài)下,普伐他汀能激活A(yù)MPK α 2/AP-2 α/MMP2信號(hào)通路。為觀察小鼠效應(yīng)的平移適用性,即檢驗(yàn)這些效應(yīng)是否表現(xiàn)在人VSMCs上,應(yīng)用AngⅡ和普伐他汀刺激人VSMCs。結(jié)果發(fā)現(xiàn)普伐他汀同樣能激活靜息或者AngⅡ刺激狀態(tài)下人VSMCs中的pAMPK和pAP-2α的蛋白表達(dá)水平以及MMP-2的蛋白和mRNA表達(dá)水平。4.11慢病毒敲除AMPK α后可消除普伐他汀促進(jìn)Apoe/小鼠AAA形成的作用與注射對(duì)照shRNA慢病毒相比,尾靜脈注射AMPKα shRNA慢病毒明顯抑制了小鼠腹主動(dòng)脈組織中的AMPKα2蛋白表達(dá)。同樣的,與對(duì)照shRNA組相比,普伐他汀顯著增加了AngⅡ誘導(dǎo)小鼠AAA的發(fā)生率和死亡率、腹主動(dòng)脈的最大直徑以及AAA組織內(nèi)彈力纖維的降解,然而尾靜脈注射AMPKα shRNA慢病毒組明顯消除了普伐他汀促進(jìn)AngⅡ誘導(dǎo)小鼠AAA形成的作用。4.12慢病毒敲除AP-2α后可消除普伐他汀對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的Apoe/小鼠AAA形成的作用與注射對(duì)照shRNA慢病毒相比,尾靜脈注射AP-2α shRNA慢病毒明顯抑制了小鼠腹主動(dòng)脈組織中的AP-2α蛋白表達(dá)。與對(duì)照shRNA組相比,普伐他汀顯著增加了 AngⅡ誘導(dǎo)小鼠AAA的形成,然而敲除AP-2α后,普伐他汀未表現(xiàn)出促進(jìn)AAA形成的作用。4.13辛伐他汀不能模仿普伐他汀激活VSMCs內(nèi)AMPKα2/AP-2α/MMP2信號(hào)通路,而且甲羥戊酸不能消除普伐他汀的這一作用不同于普伐他汀,辛伐他汀并不能增加AngⅡ刺激狀態(tài)下VSMCs中pAMPK、pAP-2α和MMP2的表達(dá)水平。而且甲羥戊酸也不能消除普伐他汀上調(diào)pAMPK、pAP-2α和MMP2表達(dá)的作用。4.14辛伐他汀不能促進(jìn)AngⅡ誘導(dǎo)的Apoe-/-小鼠AAA的形成與普伐他汀相比,辛伐他汀并沒有影響AngⅡ誘導(dǎo)的Apoe-/-小鼠AAA的發(fā)生率和死亡率以及腹主動(dòng)脈最大直徑、動(dòng)脈組織內(nèi)彈力纖維的降解和MMP-2的表達(dá)。4.15甲羥戊酸不能逆轉(zhuǎn)普伐他汀促AAA形成作用單獨(dú)甲羥戊酸治療小鼠對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的Apoe--小鼠AAA的形成不產(chǎn)生任何影響,而且甲羥戊酸也并不抑制普伐他汀對(duì)AAA的影響。4.16 AAA患者腹主動(dòng)脈組織中的pAMPK和pAP-2 α的水平增高與正常組織相比,AAA組織中pAMPK和pAP-2α的水平明顯增高。4.17服用普伐他汀患者外周血細(xì)胞中的pAMPK和pAP-2 α的水平增高。與對(duì)照患者相比,服用普伐他汀患者外周血細(xì)胞中pAMPK和pAP-2α的水平明顯增高。此外,ELISA結(jié)果顯示,普伐他汀服用患者血清中的MMP-2水平也顯著增高。5結(jié)論(1)普伐他汀促進(jìn)AngⅡ誘導(dǎo)Apoe-/-鼠AAA的發(fā)生率、死亡率和嚴(yán)重性;(2)普伐他汀通過ROS激活A(yù)MPK,使AMPKα2進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與AP-2α結(jié)合后直接磷酸化AP-2α,繼而與MMP-2的基因啟動(dòng)子形成復(fù)合物,從而活化了MMP-2的基因轉(zhuǎn)錄;(3)普伐他汀促進(jìn)AAA形成的病理機(jī)制是通過激活A(yù)MPKα2/AP-2α/MMP2信號(hào)通路,而不是依賴于HMG-CoA還原酶抑制途徑而發(fā)揮作用的。1研究背景阿霉素(adriamycin,ADR)是一種臨床常用的蒽環(huán)類化療藥物,對(duì)實(shí)體瘤及血液系統(tǒng)腫瘤均有較好的療效。然而,該藥可引發(fā)心臟的毒副作用,當(dāng)ADR在體內(nèi)累積到一定劑量時(shí)會(huì)對(duì)心臟產(chǎn)生不可逆的損害,導(dǎo)致繼發(fā)性擴(kuò)張型心肌病和充血性心力衰竭。目前,阿霉素心肌病(adriamycin-induced cardiomyopathy,ACM)的發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明,其可能的機(jī)制包括：氧化應(yīng)激、心肌細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、心肌纖維化、能量代謝異常、鈣超載、DNA損傷以及線粒體損傷等,其中心肌細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激發(fā)揮著重要的作用。目前用于減輕ADR誘導(dǎo)的心臟損害的藥物有血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(angiotensin converting enzyme inhibitors,ACEI)、血管緊張素拮抗劑(angiotensin receptor antagonists,ARB)、抗氧化劑、右雷佐生等,然而不幸的是,這些藥物還沒有獲得足夠有效的證據(jù)證明其在臨床上能常規(guī)使用。因此,尋找針對(duì)ACM安全而且有效的防護(hù)藥物,促進(jìn)ADR的安全應(yīng)用具有十分重要的臨床意義。腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system,RAS)在ACM的病理生理過程中發(fā)揮著重要作用,而抑制ACE/血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,AngⅡ)/1型血管緊張素受體(Type 1 angiotensin receptor,AT1R)軸能夠改善ACM的預(yù)后。傳統(tǒng)上,ACEI和ARB主要參與抑制AngⅡ的合成和阻止AT1R的活化;然而,AngⅡ的降解也在調(diào)控AngⅡ水平中發(fā)揮著重要的作用,特別在組織水平上。由于ACE2能使AngⅡ失活而限制其血管收縮作用以及能催化AngⅡ形成Ang(1-7)的作用,因此被認(rèn)為是RAS系統(tǒng)中治療心血管疾病的一個(gè)潛在治療靶點(diǎn)。Ang(1-7)作為AngⅡ的內(nèi)源性拮抗因子,在心血管系統(tǒng)中發(fā)揮著重要生物學(xué)作用,例如改善心臟功能、擴(kuò)張血管、抗心律失常、降低血壓等。Crackower等人首次報(bào)道了敲除ACE2基因的小鼠會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的心肌收縮功能障礙;在心肌梗死或者糖尿病心肌病的大鼠模型中,過表達(dá)ACE2基因可減少心肌間質(zhì)膠原沉積,從而改善左室重構(gòu)和功能障礙。其他研究也表明ACE2/Ang(1-7)/Mas受體軸參與心臟的生理過程及心力衰竭的病理過程。.ACE2是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種羧肽酶,屬于ACE同工酶,其中42%的催化結(jié)構(gòu)域與ACE相同。它能夠?qū)ngⅠ轉(zhuǎn)化為Ang(1-9),亦能夠高效的將AngⅡ轉(zhuǎn)化為Ang(1-7)。既往很少有研究報(bào)道過表達(dá)ACE2基因?qū)CM的直接影響,本研究擬在ACM大鼠模型的基礎(chǔ)上采用直接心內(nèi)注射ACE2腺病毒載體的方法增加大鼠體內(nèi)ACE2的活性,觀察ACE2基因直接心內(nèi)轉(zhuǎn)染或者ACEI如西拉普利對(duì)ACM的影響,并探討其治療作用的可能分子機(jī)制。2目的(1)用Wistar大鼠建立ADR誘導(dǎo)的心肌病動(dòng)物模型;(2)觀察ACE2基因和西拉普利治療在大鼠ACM中的作用;(3)探討ACE2基因保護(hù)ACM的分子機(jī)制。3方法3.1構(gòu)建ACE2過表達(dá)腺病毒載體應(yīng)用(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)方法,按引物 ACE2 F:5 '-GAAAGTTGCTCAGTGGATGGGAT-3';R:5 '-TTTGCTAAAAGGAAGTCTGAGCATC-3',從小鼠腎臟組織RNA中擴(kuò)增出小鼠ACE2基因的cDNA序列,克隆到pMD18-T載體,之后再亞克隆到pDC316載體中,構(gòu)建穿梭質(zhì)粒(pDC316-ACE2)。穿梭質(zhì)粒與腺病毒骨架質(zhì)粒進(jìn)行同源重組,形成重組腺病毒載體,然后將重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞中包裝成Ad-ACE2。3.2動(dòng)物模型的建立190只8-10周齡(體重250-300克)雄性Wistar大鼠,分為對(duì)照組(20只)和治療組(170只)。治療組大鼠給予腹腔內(nèi)注射ADR 2.5mg/kg(用高壓滅菌的三蒸水溶解),隔日1次,共計(jì)6次,累積劑量為15mg/kg。對(duì)照組給予同等劑量的三蒸水。在注射ADR的2周期間,治療組大鼠死亡10只,然后將治療組剩余大鼠隨機(jī)分為4組(每組40只):模型組、Ad-EGFP組、Ad-ACE2組和西拉普利組。大鼠腹腔注射10%水合氯醛(300mg/kg)使其完全麻醉,氣管切開連接動(dòng)物呼吸機(jī),打開胸腔,充分暴露心臟,打開心包。Ad-ACE2組大鼠用30號(hào)針在左心室壁穿刺6個(gè)部位,深度約1-2mm,然后直接注射總體積為200μlACE2腺病毒載體(2×109pfu),Ad-EGFP組注射等體積等滴度的EGFP腺病毒載體,而模型組注射200μl的無菌生理鹽水。手術(shù)結(jié)束后,大鼠繼續(xù)給予普通飲食喂養(yǎng)。西拉普利組大鼠通過灌胃給予10mg/kg/day西拉普利治療4周。病毒注射2周后,每組取8只大鼠給予安樂死,測定ACE2基因的轉(zhuǎn)染效率,剩余大鼠繼續(xù)喂養(yǎng)2周至實(shí)驗(yàn)結(jié)束,所有大鼠予以安樂死。3.3血壓測量在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,用鼠尾血壓測量儀測量所有大鼠的血壓和心率,每只大鼠測量3次后取其血壓和心率平均值。3.4心臟超聲檢查大鼠腹腔注射10%水合氯醛(300mg/kg)使其完全麻醉，連接肢體導(dǎo)聯(lián)進(jìn)行心電圖監(jiān)測,選用RMV710B探頭,以二維以及M型超聲于左室長軸或短軸檢測以下指標(biāo):左室舒張末期直徑(LVEDD)和容積(LVEDV)以及左室收縮末期直徑(LVESD)和容積(LVESV)。左室縮短分?jǐn)?shù)(FS;%)=(LVEDD-LVESD)/LVEDD × 100。左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF;%)=(LVEDV-LVESV)/LVEDV× 100。3.5 RT-PCR留取大鼠的心肌組織提取總的RNA,采用RT-PCR方法檢測ACE2的mRNA表達(dá)。3.6 免疫印跡(western blot)留取大鼠的心肌組織提取總蛋白,進(jìn)行western blot檢測ACE2、ACE、CollegenⅠ、Collegen Ⅲ、ICAM-1、VCAM-1、TNF-α、AMPK、ERK、PI3K、AKT、Bcl-2、Caspase-3、TGF-β1、MMP-1、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2 蛋白表達(dá)。3.7組織病理學(xué)檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,大鼠予以安樂死,留取心肌組織,進(jìn)行HE染色和Masson染色;免疫組織化學(xué)方法檢測心肌組織中ACE2、Ⅰ型和Ⅲ型膠原、VCAM-1和TNF-α的含量。3.8 TUNEL 染色利用TUNEL法檢測心肌細(xì)胞的凋亡。3.9酶聯(lián)免疫吸附測定(EL ISA)取新鮮的心肌組織,放入含有蛋白酶抑制劑Cocktail的IMDM培養(yǎng)基中經(jīng)超聲震碎形成組織勻漿,離心后留取上清液用于檢測;血液同樣放入含有蛋白酶抑制劑Cocktail的促凝管中,離心后留取血漿用于檢測。取組織上清液和血漿進(jìn)行 AngⅡg(1-7)ELISA 檢測。3.10 ACE2活性的測定提取心肌組織蛋白,ACE2能分解7-Mca-YVADAPK(Dnp)-OH反應(yīng)底物的C末端的2,4-二硝基苯基部分,從而促使熒光增強(qiáng)。使用酶標(biāo)儀檢測激發(fā)光為320 nm以及散射光為400 nm時(shí)的熒光強(qiáng)度,動(dòng)態(tài)檢測熒光強(qiáng)度4個(gè)小時(shí)。ACE2活性=無ACE2抑制劑時(shí)的熒光強(qiáng)度-存在ACE2抑制劑DX600時(shí)的熒光強(qiáng)度。3.11 SOD活性的測定留取大鼠的心肌組織提取總蛋白,測定蛋白濃度,根據(jù)SOD活性檢測試劑盒說明,在激發(fā)波長為550 nm用酶標(biāo)儀檢測SOD各樣品的吸光度數(shù)值,SOD活性=[(對(duì)照管吸光度-樣品管吸光度)/對(duì)照管吸光度]÷0.5×(反應(yīng)液的總體積/取樣量)÷待測樣品的蛋白濃度。4結(jié)果4.1大鼠的一般情況和死亡率與對(duì)照組相比,模型組和Ad-EGFP組大鼠均出現(xiàn)皮毛粗糙失去光澤、腹瀉、眼睛周圍紅色分泌物、腹部腫大、腹水等現(xiàn)象,然而Ad-ACE2組大鼠無上述癥狀,西拉普利組大鼠僅表現(xiàn)輕度的上述癥狀。從腺病毒注射到4周實(shí)驗(yàn)結(jié)束開始計(jì)算,模型組、Ad-EGFP組、Ad-ACE2組、西拉普利組大鼠的死亡率分別為71.88%、75.00%、18.75%、46.88%。對(duì)照組大鼠未發(fā)現(xiàn)死亡。與模型組和Ad-EGFP組相比,Ad-ACE2組和西拉普利組大鼠的死亡率明顯的下降。Ad-ACE2組大鼠的死亡率顯著低于西拉普利組。4.2 ACE2的轉(zhuǎn)染效率在病毒轉(zhuǎn)染后2周觀察大鼠心肌組織內(nèi)ACE2的轉(zhuǎn)染效率,與對(duì)照組相比,模型組和Ad-EGFP組大鼠心肌組織中ACE2 mRNA和蛋白表達(dá)水平以及活性顯著增高,而模型組與Ad-EGFP組大鼠心肌組織中ACE2的含量無明顯差別。與模型組和Ad-EGFP組相比,過表達(dá)ACE2或西拉普利治療顯著增加了 ACE2 mRNA和蛋白表達(dá)水平以及活性;而且西拉普利組大鼠心肌組織中ACE2的含量顯著低于Ad-ACE2組。4.3 HE染色對(duì)照組心肌組織可見心肌細(xì)胞排列整齊,胞核大小均一,無心肌纖維破壞,細(xì)胞間隙正常。模型組和Ad-EGFP組心肌細(xì)胞肥大,心肌纖維斷裂,炎癥侵潤。Ad-ACE2組和西拉普利組的上述病理學(xué)改變較模型組和Ad-EGFP組明顯減輕,然而西拉普利組減輕的程度不如Ad-EGFP組。4.4心肌中ACE2和ACE的表達(dá)在病毒轉(zhuǎn)染4周實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,Western blot檢測結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,模型組和Ad-EGFP組ACE2的表達(dá)僅輕度增加,無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;與模型組Ad-EGFP組和西拉普利組相比,Ad-ACE2組ACE2的表達(dá)則顯著增加。模型組和Ad-EGFP組ACE的表達(dá)明顯高于對(duì)照組、Ad-ACE2組和西拉普利組,模型組與Ad-EGFP組或者Ad-ACE2組與西拉普利組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4.5心肌和血漿中Ang(1-7)和AngⅡ的水平ELISA檢測結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,模型組和Ad-EGFP組大鼠心肌和血漿中的Ang(1-7)和AngⅡ的水平均顯著增加,模型組與Ad-EGFP組相比無明顯差異;與模型組和Ad-EGFP組相比,Ad-ACE2組和西拉普利組大鼠心肌和血漿中的Ang(1-7)的水平可進(jìn)一步顯著增加,而AngⅡ的水平則顯著降低;與西拉普利組相比,ACE2過表達(dá)使大鼠心肌和血漿中的Ang(1-7)的水平明顯增加,而AngⅡ的水平則顯著降低4.6 TUNEL染色以及c-caspase3和Bcl-2蛋白表達(dá)TUNEL染色結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,模型組和Ad-EGFP組大鼠心肌組織中TUNEL染色陽性細(xì)胞相對(duì)含量顯著增高,而模型組與Ad-EGFP組差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與模型組和Ad-EGFP組相比,Ad-ACE2組和西拉普利組大鼠心肌組織中TUNEL染色陽性細(xì)胞相對(duì)含量則明顯降低,而Ad-ACE2組與西拉普利組差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。模型組和Ad-EGFP組c-caspase3的蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組、Ad-ACE2組和西拉普利組;模型組與Ad-EGFP組或者Ad-ACE2組與西拉普利組c-caspase3的蛋白表達(dá)無明顯差異。與對(duì)照組相比,模型組和Ad-EGFP組Bcl-2的蛋白表達(dá)明顯減低,模型組與Ad-EGFP組相比無明顯差異;Ad-ACE2組和西拉普利組Bcl-2的蛋白表達(dá)較模型組和Ad-EGFP組明顯增加;而相比于西拉普利組,ACE2過表達(dá)使大鼠心肌組織中Bcl-2的蛋白表達(dá)顯著增加。4.7 AMPK的蛋白表達(dá)與模型組和Ad-EGFP組相比,ACE2過表達(dá)和西拉普利處理可顯著增加AMPK的磷酸化;而相比于Ad-ACE2組,西拉普利處理使大鼠心肌組織中AMPK的磷酸化顯著降低。4.8炎癥因子的表達(dá)免疫組化結(jié)果顯示,Ad-ACE2組和西拉普利組VCAM-1及TNF-α的表達(dá)較模型組和Ad-EGFP組顯著降低;而與西拉普利組相比,Ad-ACE2組VCAM-1及TNF-α的表達(dá)明顯的增多。Western blot檢測結(jié)果同樣顯示,模型組和Ad-EGFP組ICAM-1、VCAM-1及TNF-α表達(dá)明顯高于對(duì)照組、Ad-ACE2組和西拉普利組;模型組與Ad-EGFP組或者Ad-ACE2組與西拉普利組ICAM-1的表達(dá)無明顯差異。4.9 NOX2、P47和iNOS的表達(dá)及SOD活性Western blot檢測結(jié)果顯示模型組和Ad-EGFP組NOX2和P47的表達(dá)明顯高于對(duì)照組、Ad-ACE2組和西拉普利組,模型組與Ad-EGFP組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與西拉普利組相比,Ad-ACE2組P47的表達(dá)明顯降低,而NOX2的表達(dá)無明顯差異。模型組和Ad-EGFP組SOD的活性明顯低于對(duì)照組、Ad-ACE2組和西拉普利組,模型組與Ad-EGFP組SOD的活性無明顯差別;與西拉普利組相比,Ad-ACE2組SOD的活性顯著降低。Western blot檢測結(jié)果顯示,Ad-ACE2組和西拉普利組iNOS的表達(dá)較模型組和Ad-EGFP組顯著降低,模型組與Ad-EGFP組或者Ad-ACE2組與西拉普利組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4.10 ERK的蛋白表達(dá)Western blot檢測結(jié)果顯示,與模型組和Ad-EGFP組相比,ACE2過表達(dá)和西拉普利處理可顯著減低ERK的磷酸化,而模型組與Ad-EGFP組或者Ad-ACE2組與西拉普利組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4.11 PI3K和AKT的蛋白表達(dá)Western blot檢測結(jié)果顯示,與對(duì)照組、模型組和Ad-EGFP組相比,ACE2過表達(dá)和西拉普利處理可顯著增加PI3K和AKT的磷酸化,而相比于Ad-ACE2組,西拉普利處理使大鼠心肌組織中AMPK的磷酸化顯著降低。4.12心率、血壓及心臟超聲測定結(jié)果各組間大鼠的心率無顯著差異。與對(duì)照組相比,其余各組大鼠血壓均顯著降低,但Ad-ACE2組及西拉普利組大鼠血壓與模型組及Ad-EGFP組相比無差別。心臟超聲測定結(jié)果顯示,與模型組和Ad-EGFP組相比,Ad-ACE2組和西拉普利組LVESD和LVEDD顯著降低,而LVEF和FS則顯著增加;相比于西拉普利組,Ad-ACE2組LVEF和FS顯著增加,左室舒張末期直徑則顯著降低。4.13膠原的表達(dá)Masson染色顯示,與模型組和Ad-EGFP組相比,而ACE2過表達(dá)和西拉普利處理可顯著減低膠原沉積;而相比于西拉普利組,ACE2過表達(dá)使大鼠心肌組織中的膠原沉積更加顯著降低;模型組與Ad-EGFP組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。免疫組化和western blot檢測結(jié)果均顯示模型組和Ad-EGFP組Ⅰ型和Ⅲ型膠原的表達(dá)明顯高于對(duì)照組、Ad-ACE2組和西拉普利組,模型組與Ad-EGFP組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與西拉普利組相比,ACE2過表達(dá)可顯著降低大鼠心肌組織中的Ⅲ型膠原的表達(dá),而對(duì)Ⅱ型膠原的表達(dá)無明顯影響4.14 MMP-9、MMP-1、TIMP-1、TIMP-2 和 TGF-β 1 的表達(dá)Western blot檢測結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,模型組和Ad-EGFP組MMP-9的表達(dá)顯著增加,而模型組與Ad-EGFP組MMP-9的表達(dá)無明顯差異;與模型組和Ad-EGFP組相比,Ad-ACE2組和西拉普利組MMP-9的表達(dá)增加更加顯著,Ad-ACE2組與西拉普利組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各組間大鼠心肌組織中MMP-1、TIMP-1以及TIMP-2的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Western blot檢測結(jié)果顯示模型組和Ad-EGFP組TGF-β1的表達(dá)明顯高于對(duì)照組、Ad-ACE2組和西拉普利組,而模型組與Ad-EGFP組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與西拉普利組相比,Ad-ACE2組TGF-β1的表達(dá)明顯降低。5結(jié)論(1)ACE2基因治療明顯改善ACM心肌重構(gòu)和收縮功能障礙以及降低ACM大鼠的死亡率;(2)ACE2基因治療發(fā)揮心臟保護(hù)作用的分子機(jī)制包括ACE2抑制心肌細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激以及心肌纖維化;活化AMPK、PI3K和AKT的磷酸化;抑制ERK1/2的磷酸化及TGF-β1表達(dá);降低心肌組織中AngⅡ含量而增加Ang(1-7)的含量;(3)ACE2基因?qū)CM的治療效果優(yōu)于西拉普利。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R543.16

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 ;Overexpression of angiopoietin-1 reduces doxorubicin-induced apoptosis in cardiomyocytes[J];Journal of Biomedical Research;2012年06期

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本文編號(hào)：1566423