本文關(guān)鍵詞： 癲癇 癲癇發(fā)作 細(xì)胞骨架連接整合素相關(guān)蛋白（泛素樣蛋白1） GABAA受體　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：第一部分Plic-1在顳葉癲癇患者及動物模型中的表達(dá)目的：檢測Plic-1在難治性顳葉癲癇患者及氯化鋰-皮羅卡品癲癇大鼠腦組織中的表達(dá)及時空關(guān)系。 方法： 1.從課題組收集建立的難治性癲癇患者術(shù)后腦組織庫中隨機抽取30例作為實驗組，非癲癇（年齡、性別匹配）腦外傷患者腦組織（皮質(zhì)）10例作為對照組。 2.成年雄性SD大鼠共24只（體重220-280g，2-3月齡）隨機分為正常對照組（n=8）和癲癇實驗組，實驗組再分成有自發(fā)性發(fā)作（2m，n=8/組）和無自發(fā)性發(fā)作組（2m，n=8/組），實驗組均予以氯化鋰-匹羅卡品腹腔注射造模。 3．用Western blot檢測Plic-1的表達(dá)，免疫熒光雙標(biāo)檢測Plic-1表達(dá)部位。 結(jié)果： 1.顳葉癲癇患者術(shù)后腦組織及對照組腦組織中均有Plic-1表達(dá)，其中Plic-1在癲癇患者腦組織中表達(dá)較對照組明顯減弱（*p＜0.01）。 2.匹羅卡品誘發(fā)的癲癇大鼠模型中，有自發(fā)性發(fā)作的動物皮質(zhì)Plic-1表達(dá)水平較無自發(fā)性發(fā)作及對照組明顯降低（*p＜0.05）；有自發(fā)性發(fā)作動物海馬中Plic-1表達(dá)水平較無自發(fā)性發(fā)作組及對照組降低（*p＜0.05）。免疫熒光雙標(biāo)顯示Plic-1在癲癇模型海馬中神經(jīng)元胞漿、胞核表達(dá)，在星形膠質(zhì)細(xì)胞中不表達(dá)。同時研究發(fā)現(xiàn)Plic-1在癲癇模型腦組織中與GABAARβ2/3亞基存在共表達(dá)。 結(jié)論：我們的研究發(fā)現(xiàn)Plic-1在癲癇患者腦組織及慢性自發(fā)性發(fā)作的匹羅卡品癲癇大鼠腦組織中表達(dá)均降低，且Plic-1與GABAAR存在共表達(dá)，提示Plic-1可能參與了癲癇的發(fā)生發(fā)展。 第二部分阻止Plic-1與GABAA受體結(jié)合多肽對兩種癲癇動物模型行為學(xué)的影響 目的：研究阻止Plic-1與GABAA受體結(jié)合多肽對癲癇大鼠行為學(xué)及GABAAR表達(dá)的影響。 方法： 1.構(gòu)建多肽段PePα，通過立體定位顯微注射到大鼠雙側(cè)海馬CA1區(qū)，以選擇性抑制Plic-1與GABAA受體結(jié)合，，從而探索Plic-1對大鼠癲癇行為學(xué)的影響及GABAAR表達(dá)變化。 2.成年雄性SD大鼠48只(220-280g,2-3月齡)隨機分為兩組，分別建立氯化鋰-匹羅卡品和戊四氮動物模型，每組24只。每一種模型又分為三組： Control組（n=8）、Scrambled peptide組（n=8）和PePα peptide組（n=8）；分別微量注射10μl（1mg/kg）PePα peptide溶液、Scrambledpeptide溶液或生理鹽水。注射完畢后分別予氯化鋰-匹羅卡品或戊四氮點燃。 3.行為學(xué)評分：在氯化鋰-匹羅卡品模型中分別觀察發(fā)作的潛伏期和用Racine評分觀察發(fā)作的嚴(yán)重程度。在戊四氮模型中主要觀察發(fā)作潛伏期、PTZ嚴(yán)重程度評分、GTCs發(fā)生率。 4.用免疫熒光雙標(biāo)檢測各組海馬CA1區(qū)Plic-1與GABAARβ2/3陽性細(xì)胞熒光強度及雙標(biāo)細(xì)胞計數(shù)差異，用Western-blot檢測癲癇發(fā)作后各組海馬中Plic-1及GABAARβ2/3表達(dá)差異。 結(jié)果： 1．研究發(fā)現(xiàn)在匹羅卡品動物模型中點燃動物發(fā)作潛伏期在PePα peptide組較Control組及Scrambled peptide組明顯縮短(*P0.01);在PePα peptide組中發(fā)作的嚴(yán)重程度（Racine評分）也較其他對照組明顯增高，其中以注射匹羅卡品后3個時間點（10min、20min及60min）具有統(tǒng)計學(xué)差異（*P0.05）。 在戊四氮模型中的行為學(xué)研究也發(fā)現(xiàn)癲癇動物發(fā)作潛伏期在PePαpeptide組較其他對照組明顯縮短，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（*P0.05）；PePαpeptide組中嚴(yán)重程度PTZ評分較其他對照組更重（*P0.05）；PePα組的GTC發(fā)作率也較其他對照組增加（*P0.05）。 2. PePα peptide組中GABAARβ2/3陽性細(xì)胞熒光強度較Control組及Scrambled peptide組明顯減低，且有統(tǒng)計學(xué)差異(*P0.05）。PePαpeptide組中Plic-1與GABAARβ2/3雙標(biāo)重合陽性細(xì)胞計數(shù)與Control組及Scrambled peptide組比較無明顯統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。 3. PePα peptide組中GABAARβ2/3的表達(dá)水平較Control組及Scrambled peptide組明顯降低（*P0.05），但Plic-1表達(dá)水平與兩對照組間的差異在統(tǒng)計學(xué)上無顯著意義（P＞0.05）。 結(jié)論：我們的研究發(fā)現(xiàn)實驗多肽能通過阻制Plic-1與GABAA受體結(jié)合影響癲癇的發(fā)生發(fā)展，從另一角度支持Plic-1可能參與了癲癇的發(fā)生發(fā)展。 第三部分過表達(dá)Plic-1對癲癇動物行為學(xué)及GABAAR表達(dá)的影響 目的：了解過表達(dá)Plic-1對實驗大鼠癲癇發(fā)作行為學(xué)及GABAAR表達(dá)的影響。 方法： 1.構(gòu)建攜帶有過表達(dá)Plic-1基因的慢病毒載體。 2.成年雄性SD大鼠24只(220-280g,2-3月齡)隨機分為Control組（n=8）、LV-GFP組（n=8）和LV-Plic-1組（n=8），分別在大鼠雙側(cè)海馬CA1區(qū)微量注射20μl病毒溶液（LV-Plic-1組）或?qū)φ杖芤海↙V-GFP組）或生理鹽水（Control組）。注射完畢后2周予以戊四氮點燃。 3.行為學(xué)評分：分別觀察PTZ嚴(yán)重程度、發(fā)作潛伏期、GTCs發(fā)作率，了解其對點燃動物行為學(xué)的影響。 4.用免疫熒光檢測各組間海馬CA1區(qū)GABAARβ2/3陽性細(xì)胞熒光強度，用Western-blot檢測癲癇發(fā)作后各組海馬中Plic-1及GABAARβ2/3的表達(dá)差異。 結(jié)果： 1．LV-Plic-1組中嚴(yán)重程度PTZ評分較LV-GFP及Control對照組輕，有統(tǒng)計學(xué)差異（*P0.05）。點燃動物發(fā)作潛伏期在LV-Plic-1組較其他對照組延長，但無統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）；GTC發(fā)作率在LV-Plic-1組較其他對照組減少，也無統(tǒng)計學(xué)顯著性（P＞0.05）。 2．免疫熒光強度：LV-Plic-1組中GABAARβ2/3陽性細(xì)胞熒光強度較LV-GFP及Control對照組明顯增加(*P0.01）。 3. LV-Plic-1組中Plic-1表達(dá)水平較LV-GFP及Control對照組明顯增加(*P0.05)。LV-Plic-1組中GABAARβ2/3亞基的表達(dá)也較其他對照組明顯增加(*P0.05)。 結(jié)論：通過上述研究，我們認(rèn)為Plic-1可能通過調(diào)節(jié)GABAAR的表達(dá)及功能影響了癲癇的發(fā)生。 第四部分Plic-1對點燃動物神經(jīng)元抑制功能的影響目的：探討Plic-1對點燃動物神經(jīng)元抑制功能的影響及其可能的潛在機制。 方法： 1.雄性SD大鼠16只（P14-P28）隨機分為Scrambled peptide+Mg-free組（n=8）和PePα peptide+Mg-free組（n=8）,取材前不做任何干預(yù)。麻醉后直接取材制備海馬腦片，無鎂灌注液中構(gòu)建無鎂癲癇模型后將多肽抑制劑加入灌流液中，采用全細(xì)胞膜片鉗檢測多肽抑制劑干預(yù)Plic-1與GABAAR結(jié)合前后對海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元抑制性突觸后電流（mIPSC）的幅值、頻率、衰減時間的影響。 2.成年雄性SD大鼠25只(220-280g,2-3月齡)隨機分為Control組（n=5）、LV-GFP組（n=5）和LV-Plic-1組（n=5），分別在大鼠雙側(cè)海馬CA1區(qū)微量注射20μl病毒溶液（LV-Plic-1組）或?qū)φ杖芤海↙V-GFP組）或生理鹽水（Control組）。注射完畢后2周予以戊四氮點燃。點燃后取材制備海馬腦片，將制備好腦片放于無鎂灌流液中灌流，采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測各組中海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元抑制性突觸后電流（mIPSC）的幅值、頻率、衰減時間。 結(jié)果： 1. PePα peptide組中海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元抑制性突觸后電流（mIPSC）總mIPSC幅值、mIPSC平均頻率均較scrambled peptide組及灌流前明顯減少(*P＜0.01)；PePα peptide組中mIPSC總衰減時間（Decay Time）較對照組及灌流前明顯縮短(*P＜0.05）。 3. LV-Plic-1組中海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元抑制性突觸后電流（mIPSC）總mIPSC幅值、mIPSC平均頻率均較Control組及LV-GFP組明顯增高（*P＜0.05）。LV-Plic-1組中mIPSC總衰減時間（Decay Time）較其他對照組顯著延長(*P0.01)。此外，該增高電流可被GABAAR特異性抑制劑Bicuculline完全抑制。結(jié)論： Plic-1抗癲癇機制可能是通過增強GABAAR介導(dǎo)的抑制性突觸后電流增強抑制功能從而影響癲癇發(fā)生。
[Abstract]:Part I expression of Plic-1 in patients with temporal lobe epilepsy and animal model objective: detection of Plic-1 in patients with refractory temporal Ye Dianxian and lithium chloride pilocarpine epilepsy rat brain tissue the expression and relationship between time and space.
Method錛

本文編號：1553607