本文關(guān)鍵詞： 光動(dòng)力治療法 納米金 靶向肽 SKOV-3細(xì)胞　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2015年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景卵巢癌(ovarian cancer)是女性生殖道常見(jiàn)的惡性腫瘤,在女性生殖道腫瘤中居第2位,僅次于宮頸癌,最近五年的調(diào)查中顯示其發(fā)病率較2005-2010年期間上升了6%。卵巢癌早期診斷困難,易發(fā)生轉(zhuǎn)移,一旦確診往往是中晚期,治愈率低,嚴(yán)重威脅患者的健康。卵巢癌對(duì)放療敏感性低,化療主要經(jīng)過(guò)全身靜脈注射或腹腔穿刺注入藥物的方法,副作用大、易產(chǎn)生耐藥性等缺點(diǎn)難以達(dá)到預(yù)期效果,無(wú)論何種方法即使聯(lián)合輔助治療,卵巢癌患者5年生存率僅達(dá)到32%。為降低副作用和提高治療效果,將生物治療和物理治療有機(jī)相結(jié)合,利用具有生物活性的多肽分子和生物材料化學(xué)偶聯(lián)的方式,使多肽分子能在某些腫瘤細(xì)胞膜或細(xì)胞的特異性表達(dá)和整合功能,從而能更有效地殺傷腫瘤細(xì)胞。該方法可用于阻斷腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、抑制或殺死腫瘤細(xì)胞。從而達(dá)到消除腫瘤的目的,提高卵巢癌患者的治愈率。卵巢癌主要通過(guò)淋巴管來(lái)轉(zhuǎn)移,有報(bào)道稱(chēng)新生淋巴可促進(jìn)癌細(xì)胞浸潤(rùn)正常組織和轉(zhuǎn)移,抑制腫瘤新生淋巴管的生成將成為診斷與治療為腫瘤的一個(gè)新的可行性方法。研究顯示,VEGF-C和VEGFR-3可誘導(dǎo)腫瘤內(nèi)部新生淋巴管的形成以及腫瘤組織周?chē)馨凸艿臄U(kuò)張,我們課題組成員前期研究顯示,抑制VEGFR-3的生成可顯著抑制卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。VEGFR-3主要在腫瘤淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá),在腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞有少量表達(dá),但在正常的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)基本很少表達(dá)。這或許使VEGFR-3作為卵巢癌淋巴管的靶向性治療分子提供了新的可行性[19-22]。本課題組成員在前期研究中用四輪肽庫(kù)篩選技術(shù)分析得到15肽(氨基酸序列為：SHSWHWLPNLRHYAS),在體外免疫熒光實(shí)驗(yàn)和ELISA檢測(cè)中,該肽與VEGFR-3胞外區(qū)蛋白都有很強(qiáng)的親和能力,親和常數(shù)(2.37±1.10)×106M-1[23-24],并發(fā)現(xiàn)15肽與VEGFR-3結(jié)合以后能抑制淋巴管的生成；通過(guò)碘131顯像技術(shù)證明標(biāo)記15肽對(duì)卵巢癌具有靶向性,在腫瘤組織呈富集性聚集。然而另有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌細(xì)胞本身能分泌VEGF-C因子,且卵巢癌組織高表達(dá)VEGFR-3,通過(guò)干擾卵巢癌細(xì)胞自分泌和旁分泌的形式抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[251,另有研究發(fā)現(xiàn)在卵巢癌組織和細(xì)胞、子宮頸癌、胃癌組織和細(xì)胞、VEGFR-3高表達(dá)[26-28],因此本研究選擇對(duì)VEGF-C有競(jìng)爭(zhēng)作用的15肽,發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。2003年,Hirara等通過(guò)利用beta-catenin (ctnnb1)這種調(diào)控蛋白,該蛋白作用在膀胱癌細(xì)胞中阻礙VEGF-C的生成,從而抑制了癌細(xì)胞的擴(kuò)散,可以有效的延緩患者的病情,這種通過(guò)利用生物多肽配合患者進(jìn)行手術(shù)以及在放化療等多醫(yī)療手段中的合同作用。多肽與靶向組織有特異的結(jié)合性能,但對(duì)細(xì)胞的作用局限,往往結(jié)合在細(xì)胞表面,缺乏對(duì)細(xì)胞的穿透性能,需要與其它物質(zhì)連接可以增加生物學(xué)活性,納米技術(shù)研究已深入醫(yī)學(xué)、生命科學(xué)等領(lǐng)域。納米金粒子直徑在1-250nm,因其粒徑微小,具有量子效應(yīng)、表面效應(yīng)和宏觀熱效應(yīng)。利用納米粒子的特殊優(yōu)勢(shì),通過(guò)表面修飾,可以實(shí)現(xiàn)生物分子運(yùn)載、藥物導(dǎo)彈載體、藥物包裹等,這將提升現(xiàn)有診斷醫(yī)療水平,實(shí)現(xiàn)局部病變的治療,病變的局部給藥,減少了對(duì)健康器官的損傷,極大地降低了腫瘤等疾病治療的副作用,這些特點(diǎn)為開(kāi)發(fā)新藥提供了可能。利用納米材料宏觀熱效應(yīng),將納米材料作為光熱治療的光敏劑,在光的作用下,會(huì)讓身體的癌細(xì)胞發(fā)生形變或生物分子發(fā)生變化,將導(dǎo)致細(xì)胞損傷和壞死,這一反應(yīng)要有氧的參與,所以該種效應(yīng)又稱(chēng)光敏化-氧化作用或者光動(dòng)力療法。其原理是通過(guò)光化學(xué)反應(yīng)的作用將光能轉(zhuǎn)化為分子的內(nèi)能,從而使分子利用內(nèi)能使細(xì)胞產(chǎn)生多種活性的氧分子,進(jìn)而破壞細(xì)胞的亞細(xì)胞纖維結(jié)構(gòu),致使細(xì)胞出現(xiàn)凋亡或死亡。目前這一技術(shù)已成功應(yīng)用于臨床上食管癌患者、肺癌患者等腫瘤晚期患者、復(fù)發(fā)性患者的姑息性治療,并取得了明顯的療效。由于修飾的納米材料可在異常增生的組織腫瘤中選擇性聚積,臨床上對(duì)光照的波長(zhǎng)、強(qiáng)度和部位進(jìn)行選擇,已達(dá)到最小病變組織的治療,減少治療的副作用。該方法特異性比較好,適用性比較強(qiáng),同時(shí)毒性較低,可協(xié)同手術(shù)以提高療效,并且選擇性好、可姑息治療、消滅隱性病灶,還能夠保護(hù)重要器官功能、可以進(jìn)行重復(fù)治療,由于該方法創(chuàng)傷很小,所以可以減少患者的痛苦。Kelly等利用光敏效應(yīng)與靶向生物分子相結(jié)合在肝腫瘤研究中均有相關(guān)報(bào)道�；�15肽與卵巢癌組織的靶向性結(jié)合和抑制作用,以及納米金本身的光動(dòng)力作用、穿透性能、表面易修飾等特點(diǎn),本文利用聚吡咯修飾合成納米金花,結(jié)合15P(SHSWHWLPNLRHYAS)靶向分子,研究其對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制及其殺傷作用機(jī)制。研究目的通過(guò)化學(xué)合成的聚吡咯修飾的納米金花為光敏劑,以合成的具有與VEGFR-3競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合作用的靶向多肽為媒介的新材料15肽介導(dǎo)的聚吡咯修飾納米金花(Gold nanorods of 15-pentadecapeptide,15P-PPy-NPS)。探討不同劑量光敏劑、不同激光光照時(shí)間、不同光照頻率下對(duì)卵巢癌腫瘤細(xì)胞的殺傷效果。卵巢癌細(xì)胞培養(yǎng)和裸鼠腫瘤模型的構(gòu)建以及納米材料的生物安全性評(píng)價(jià),研究納米金新材料光動(dòng)力腫瘤抑制率及殺傷機(jī)制。期望具有靶向作用的納米金花新材料能為卵巢癌的臨床治療研究提供新的思路。研究方法1.合成15P-PPy-NPS并進(jìn)行系列表征與鑒定采用還原氯金酸制備納米金,用聚吡咯修飾以增大表面積,篩選花狀納米金。通過(guò)粒徑比較篩選,PH值穩(wěn)定性能,激光照射頻率以及光熱轉(zhuǎn)化效率等方面評(píng)價(jià)納米金花靶向肽的化學(xué)、物理、生物活性。通過(guò)電鏡、紫外紅外吸收光譜及其表征鑒定。15P是通過(guò)肽庫(kù)篩選技術(shù),經(jīng)過(guò)隨機(jī)4輪親和實(shí)驗(yàn)篩選出的,與VEGFR3特定區(qū)域蛋白(胞外區(qū))具有較強(qiáng)的親和力,將其與納米金花通過(guò)酰胺鍵共價(jià)鍵偶聯(lián),合成15P-PPy-NPS。2.15P-PPy-NPS體外篩選腫瘤細(xì)胞株通過(guò)MTT法、Cell scratch實(shí)驗(yàn)、Transwell細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)、熒光顯微鏡下觀察15P-PPy-NPS侵入細(xì)胞實(shí)驗(yàn),比較各種癌細(xì)胞株的活性、侵染性、對(duì)15P-PPy-NPS材料的敏感性及細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率,從HO-8910、SW626、SKOV-3、RL95-2、HeLa229、 HeLa-S3等細(xì)胞中篩選特異細(xì)胞株。完成癌細(xì)胞對(duì)納米金花、15肽、不同激光頻率照射和時(shí)間等條件下細(xì)胞凋亡情況的檢測(cè)。3.15P-PPy-NPS對(duì)動(dòng)物模型光熱抑制腫瘤生長(zhǎng)用腫瘤細(xì)胞SKOV-3,使小鼠患人卵巢癌,等腫瘤大小合適時(shí),鼠尾靜脈注射光敏材料15P-PPy-NPS、NPS15肽、生理鹽水,結(jié)合激光照射,一定頻率下,每天記錄實(shí)驗(yàn)鼠腫瘤增長(zhǎng)狀況,裸鼠活動(dòng)狀況,裸鼠進(jìn)食量、對(duì)治療的適應(yīng)性等。用0.1%戊巴比妥麻醉后,取出病患部位免疫化學(xué)分析,檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡狀況。4.NPS和15P-PPy-NPS對(duì)內(nèi)臟組織的損傷檢測(cè)取15P-PPy-NPS治療的實(shí)驗(yàn)鼠,激光照射后取肝、脾、腎內(nèi)臟器官做石蠟組織切片,通過(guò)熒光掃描電子顯微鏡觀測(cè)臟器細(xì)胞凋亡或死亡狀況,分析15P-PPy-NPS光敏材料所帶來(lái)的副作用及潛在的毒性危害。研究結(jié)果1.完成還原法氯金酸制備納米金花,對(duì)納米金用不同厚度的聚吡咯包被,pH值適用范圍在pH1-9內(nèi)分散均勻、形貌特征明顯,3W/cm2的808nnm激光照射下性質(zhì)穩(wěn)定；合成15肽,將其與納米金花通過(guò)酰胺鍵共價(jià)鍵偶聯(lián),質(zhì)譜分析,條件篩查,光譜檢測(cè)結(jié)果表明,15肽聚吡咯修飾的納米金花偶聯(lián)成功。2.鏡下觀察細(xì)胞加入15P-PPy-NPS材料30min后主要分布在細(xì)胞膜附近,少部分侵入細(xì)胞內(nèi),60min后進(jìn)可明顯的觀測(cè)到材料在胞體內(nèi)富集。多種婦科腫瘤細(xì)胞株對(duì)15P-PPy-NPS材料MTT敏感性表明：HO-8910抑制率為53%,SW626抑制率為53%,RL95-2抑制率為48%,SKOV-3抑制率為75%,HeLa-S3為63%,HeLa229為51%。通過(guò)Hochest33342單染結(jié)果15P-PPy-NPS+照射組的治療結(jié)果表明細(xì)胞凋亡明顯,15P-PPy-NPS+照射組的細(xì)胞凋亡率達(dá)84.93%、NPS+照射組達(dá)71.83%、15肽+照射組52.74%、15P-PPy-NPS組15.72%、15肽組16.49%、NPS組17.36%、激光照射組24.17%；空白組12.0%。3.15P-PPy-NPS對(duì)裸鼠光熱治療結(jié)果：腫瘤抑制率(%)：15P-PPy-NPS+照射組細(xì)胞23.57±2.626、NPS+照射組16.61士0.7915、15肽+照射組8.926±1.651、15P-PPy-NPS組5.883±1.625、NPS組1.584±0.5264、15肽組6.159+1.403、激光照射組1.430±1.788,空白組-18.65±3.901。各組間治療前后體重?zé)o變化。Tunel染色和PI、Hoechst染色表明：15P-PPy-NPS+照射組細(xì)胞凋亡率達(dá)78.51%、NPS+照射組達(dá)62.10%、15肽+照射組37.48%、15P-PPy-NPS組22.5%、NPS組11.69%、15肽組19.67%、激光照射組10.02%,空白組4.09%。第一組、二組與其它各比較均有顯著性差異(P0.001；P0.05)4.通過(guò)15P-PPy-NPS材料尾經(jīng)脈注射實(shí)驗(yàn)Skov-3中瘤裸鼠,結(jié)合激光照射治療后,取實(shí)驗(yàn)鼠臟器,肝臟、腎臟、脾臟等器官,經(jīng)包埋處理石蠟組織切片表明15P-PPy-NPS材料注射組和空白組中肝、腎、脾中細(xì)胞凋亡率沒(méi)有差異。說(shuō)明材料15P-PPy-NPS對(duì)實(shí)驗(yàn)裸鼠在器官細(xì)胞上沒(méi)有造成損害,佐證了15P-PPy-NPS光敏材料的安全性。結(jié)論本論文通過(guò)合成聚毗咯修飾納米金花,結(jié)合多肽分子靶向性,為光動(dòng)力治療腫瘤細(xì)胞提供高效,穩(wěn)定的光敏劑,利用激光照射實(shí)驗(yàn)鼠腫瘤為手段達(dá)到抑制甚至殺死癌細(xì)胞的目的,為惡性腫瘤的治療提供了新思路。1.成功地合成了聚吡咯包覆6nm納米金花,合成15肽,并將15肽和納米金NPS偶聯(lián),通過(guò)質(zhì)譜分析、紫外化學(xué)分析等手段對(duì)納米金NPS、15肽、15P-PPy-NPS的結(jié)構(gòu),穩(wěn)定性,光熱轉(zhuǎn)換效率等方面進(jìn)行檢測(cè)。為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了材料基礎(chǔ)。2.成功地從六種相關(guān)的婦科腫瘤細(xì)胞中篩選出在15P-PPy-NPS為光敏劑作用下能高效的殺傷癌細(xì)胞的細(xì)胞株,構(gòu)建SKOV-3細(xì)胞模型。為動(dòng)物模型構(gòu)建提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。3.成功構(gòu)建人卵巢腺細(xì)胞SKOV-3荷瘤裸鼠模型,15P-PPy-NPS輔助激光照射抑制了腫瘤的生長(zhǎng),腫瘤組織切片出現(xiàn)大量的凋亡細(xì)胞甚至死亡細(xì)胞,這為臨床光熱治療提供新型光敏劑,結(jié)合紅外激光照射有效殺傷癌細(xì)胞提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。4.對(duì)實(shí)驗(yàn)鼠的體重變化,進(jìn)食量、活動(dòng)量、外界刺激反應(yīng)和解剖內(nèi)臟組織肝臟、脾、腎臟用：15P-PPy-NPS+激光照射治療后同空白組對(duì)比研究,組織切片凋亡表明內(nèi)臟器官受損較小,顯示了該材料進(jìn)行生物治療和光熱治療具有良好的安全性和可靠性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R737.31

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2 何路偉;染料敏化的氧化鋅“納米草坪”的構(gòu)建及其光催化制氫性能[D];上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院;2015年

3 熊海巖;鈀、鉑、金基納米催化劑的制備及其性能研究[D];山東大學(xué);2015年

4 席春曉;棒狀金納米晶及類(lèi)球形銀納米晶的可控制備與性能研究[D];山東大學(xué);2015年

5 謝芳;擇優(yōu)腐蝕制備新穎金鉑異質(zhì)納米結(jié)構(gòu)[D];山東大學(xué);2015年

6 梁瑩;Anti-cMet抗體耦合空心納米金球?qū)m頸癌光熱治療增敏之作用研究[D];山東大學(xué);2015年

7 劉晶;納米金—聲致發(fā)光分析方法研究[D];陜西師范大學(xué);2015年

8 何逸鵬;納米金與不同亞型乳腺癌細(xì)胞相互作用的初步研究[D];福建師范大學(xué);2015年

9 韋正楠;基于富勒烯@金納米等離子體的Fenton催化傳感器研究[D];重慶大學(xué);2015年

10 潘歡歡;一維半導(dǎo)體納米結(jié)構(gòu)可控制備及其光電探測(cè)器的研究[D];蘇州大學(xué);2015年

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本文編號(hào)：1546818