本文關(guān)鍵詞： 二異丙酚 細胞低氧 氧 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激　出處：《安徽醫(yī)科大學(xué)》2014年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum）是真核細胞中由膜圍成的隧道系統(tǒng)，是一種重要的細胞器，其基本生理功能包括蛋白質(zhì)的合成、修飾、加工、轉(zhuǎn)運以及Ca2+濃度的調(diào)節(jié)等。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡高度敏感，肝細胞缺氧復(fù)氧時細胞內(nèi)ATP耗竭、大量氧自由基的產(chǎn)生和鈣離子平衡紊亂，可導(dǎo)致大量未折疊或錯誤折疊蛋白堆積于內(nèi)置網(wǎng)，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)(endoplasmic reticulum stress,ERS)。 ERS是細胞一種自我保護機制，細胞為適應(yīng)外界的不良刺激，維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，相繼活化一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，通過增強內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白折疊能力，加速內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解，減少新生蛋白向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運。持續(xù)或者過強的ERS使得內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)不能重建，引起細胞自噬和凋亡造成細胞損傷。ERS途徑誘導(dǎo)細胞凋亡是不同于死亡受體途徑和線粒體途徑的第3種細胞凋亡途徑。ERS可通過C/EBP同源蛋白（CHOP）、C-JUN氨基末端激酶（JNKs）和Caspase-12途徑導(dǎo)致細胞的凋亡。 異丙酚（Propofol）是一種非巴比妥類靜脈麻醉藥，因其起效快，蘇醒迅速而完全，持續(xù)輸注后不易蓄積，目前普遍用于麻醉誘導(dǎo)、鎮(zhèn)靜及麻醉維持。研究表明，肝臟缺血前給予異丙酚，可提高其對肝損傷的耐受能力，減輕肝臟缺血再灌注損傷。但其具體機制尚不清楚，可能與其抗氧化、清除氧自由基和上調(diào)血紅素氧合酶-1（Hemeoxygenase-1,HO-1）的活力等有關(guān)。 目的 本實驗評價異丙酚預(yù)先給藥對HEPG2細胞缺氧復(fù)氧損傷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響，探討其減輕HEPG2細胞缺氧復(fù)氧損傷的機制，為指導(dǎo)臨床麻醉用藥提供理論依據(jù)。 方法 1、采用物理缺氧復(fù)氧的方法制備HEPG2細胞缺氧復(fù)氧損傷模型，模擬臨床的肝臟缺血再灌注損傷模型。采用隨機數(shù)字表法將HEPG2細胞隨機分為5組：正常對照組（control組）、缺氧6h復(fù)氧12h（H6/R12）組、缺氧12h復(fù)氧12h（H12/R12）組、缺氧24h復(fù)氧12h（H24/R12）組和缺氧48h復(fù)氧12h（H48/R12）組。采用MTT比色法檢測HEPG2細胞的相對增值情況，OD值下降40%作為缺氧復(fù)氧模型制備成功的標(biāo)準(zhǔn)。 2、明確異丙酚減輕細胞缺氧復(fù)氧損傷的最適藥物濃度，采用隨機數(shù)字表法，將HEPG2細胞隨機分為6組：正常對照組（control組）、缺氧復(fù)氧組（H/R組）和缺氧復(fù)氧+異丙酚(5μmol)組（H/R+PPF5組）、缺氧復(fù)氧+異丙酚(10μmol)組（H/R+PPF10組）、缺氧復(fù)氧+異丙酚(20μmol)組（H/R+PPF20組）和缺氧復(fù)氧+異丙酚(40μmol)組（H/R+PPF40組）。采用MTT比色法檢測HEPG2細胞的相對增值率,10μmol異丙酚用于后續(xù)實驗研究。 3、采用隨機數(shù)字表法將HEPG2細胞隨機分為4組：正常對照組（control組）、異丙酚10μmol組（PPF組）、缺氧24h復(fù)氧12h（H/R）組和缺氧24h復(fù)氧12h+異丙酚10μmol組（H/R+PPF組）。采用Western bloting (WB)方法檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白：免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白(BIP)、C/EBP同源蛋白（CHOP）、蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK）、真核細胞轉(zhuǎn)錄起始因子（eIF2α）、活化轉(zhuǎn)錄因子4（ATF4）和凋亡相關(guān)蛋白活化型Caspase-3的表達；采用RT-PCR的方法檢測BIP mRNA、CHOP mRNA、和Caspase-3mRNA的表達。 4、統(tǒng)計學(xué)處理：采用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行實驗數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x s）表示，單因素方差分析用于不同組間比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果 1.缺氧復(fù)氧對HEPG2細胞活力的影響 與control組比較，H24/R12組細胞增值率下降(P0.05)，由0.686±0.045下降至0.404±0.033，下降約40%。 2不同濃度異丙酚對缺氧復(fù)氧（H/R）損傷HepG2細胞相對增值率的影響 MTT比色法結(jié)果顯示：與control組比較， H/R組和H/R+PPF組細胞OD值下降，細胞相對增值率下降(P0.05)；與H/R組比較，H/R+PPF10組細胞OD值由0.303±0.030增加至0.505±0.079，細胞相對增值率增加最為顯著。 3異丙酚(10μmol/L)對H/R損傷HepG2細胞凋亡相關(guān)蛋白活化型Caspase-3表達的影響 與control組相比，H/R組和H/R+PPF10組細胞凋亡相關(guān)蛋白剪切型Caspase-3表達顯著上調(diào)（*P0.05）；與H/R組比較，，H/R+PPF10組細胞凋亡相關(guān)蛋白剪切型Caspase-3的表達顯著下調(diào)（#P0.05）。 4異丙酚(10μmol/L)對H/R損傷HepG2細胞Caspase-3mRNA表達的影響 與control組相比，H/R組和H/R+PPF10組細胞Caspase-3mRNA表達顯著上調(diào)（*P0.05）；與H/R組比較，H/R+PPF10組細胞Caspase-3mRNA的表達顯著下調(diào)（#P0.05）。 5異丙酚(10μmol/L)對H/R損傷HepG2細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白BIP和CHOP表達的影響 與control組相比，H/R組和H/R+PPF10組細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白BIP和CHOP的表達顯著上調(diào)（*P0.05）；與H/R組比較，H/R+PPF10組細胞的BIP和CHOP表達顯著下調(diào)（#P0.05）。 6異丙酚(10μmol/L)對H/R損傷HepG2細胞BIP mRNA和CHOP mRNA表達的影響 與control組相比，H/R組和H/R+PPF10組細胞BIP mRNA和CHOP mRNA的表達顯著上調(diào)（*P0.05）；與H/R組比較，H/R+PPF10組細胞BIP mRNA和CHOPmRNA的表達顯著下調(diào)（#P0.05）。 7異丙酚(10μmol/L)對H/R損傷HepG2細胞p-PERK、p-eIF2α和ATF4表達的影響 與control組相比，H/R組和H/R+PPF10組細胞p-PERK、p-eIF2α和ATF4的表達顯著上調(diào)（*P0.05）；與H/R組比較，H/R+PPF10組細胞p-PERK、p-eIF2α和ATF4的表達顯著下調(diào)（#P0.05）。 結(jié)論 1．異丙酚預(yù)先給藥可通過抑制細胞凋亡減輕HEPG2細胞缺氧復(fù)氧損傷； 2．異丙酚預(yù)先給藥可通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激減輕細胞凋亡； 3．異丙酚抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的作用主要是通過抑制未折疊蛋白反應(yīng)中的PERK-eIF2α-ATF4這條途徑實現(xiàn)。
[Abstract]:The endoplasmic reticulum ( endoplasmic reticulum ) is an important organelle in eukaryotic cells , and is an important organelle . Its basic physiological functions include the synthesis , modification , processing , transport and the regulation of Ca2 + concentration . The endoplasmic reticulum ( ER ) is highly sensitive to homeostasis imbalance in the cells . The intracellular ATP depletion , the generation of oxygen free radicals in the cells and the imbalance of calcium ions in the cells can result in the accumulation of a large number of unfolded or incorrectly folded proteins in the built - in network , causing the endoplasmic reticulum stress ( ERS ) . ERS is a self - protective mechanism , the cells are used to adapt to the external stimuli , maintain homeostasis of the endoplasmic reticulum environment , activate a series of signal transduction pathways , accelerate the degradation of the endoplasmic reticulum - related protein and reduce the transport of the nascent protein to the endoplasmic reticulum . Propofol ( propofol ) is a kind of non - obarbituric intravenous anesthetics . Because of its rapid onset , rapid and complete wake - up , it is not easy to accumulate after continuous infusion . It is indicated that propofol can be used for anesthesia induction , sedation and anesthesia . However , it is not clear that it may be related to antioxidant , scavenging of oxygen free radicals and increasing the activity of heme oxygenase - 1 ( HO - 1 ) . Purpose In this experiment , the effect of propofol pre - administration on the stress of the endoplasmic reticulum stress of HEPG2 cells was investigated . The mechanism of alleviating the hypoxia - induced oxygen - induced injury of HEPG2 cells was discussed , which provided the theoretical basis for the guidance of clinical anesthesia . method 鏂規(guī)硶

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本文編號：1545375