本文關鍵詞： 阿霉素腎病 骨髓間充質細胞 細胞移植 腎動脈 治療　出處：《昆明醫(yī)科大學》2014年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目 的分離、培養(yǎng)和鑒定SD大鼠骨髓間充質干細胞(MSCs),觀察MSCs靜脈移植和動脈移植的安全性以及在SD大鼠腎臟內的分布,探討MSCs移植治療慢性阿霉素腎病的可行性,并對可能的機制進行探討,為實際臨床過程中用MSCs移植的方式來治療慢性腎臟疾病提供理論基礎和實驗室依據。方法1.大鼠骨髓間充質干細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定。取12周齡雄性SD大鼠股骨和脛腓骨在磷酸鹽緩沖液里面,用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液對骨髓內腔進行全面的沖洗,將骨髓細胞的懸浮液進行收集,在其中再加入Ficoll分離液,離心30分鐘,2000 r/min之后,將沉淀下來的骨髓細胞進行收集,用磷酸鹽緩沖液(PBS緩沖液)離心10分鐘,以1600 r/min之后,將上清棄掉,PBS溶細胞接種在塑料培養(yǎng)瓶中進行接種處理,在溫度為37℃,環(huán)境為5% CO2的孵箱培養(yǎng)。經流式細胞儀檢測細胞表面型號的抗原。誘導向成骨、脂肪細胞分化以觀察細胞多項分化潛能。當骨髓MSCs P4至P6細胞經過染色的標示之后,使用0.1%的胰酶進行消化,用含10%FBS的L-DMEM培養(yǎng)基停止消化的過程之后進行離心,用不含血清的L-DMEM培養(yǎng)基來制作懸浮細胞,并且將細胞濃度調整到2x106／ml備用。大鼠骨髓間充質干細胞體外標示的具體方法：取出體外培養(yǎng)P4至P6代的BMSCs生長,當其生長到80%融合后,放置于5%CO、2%O2、93%N2的環(huán)境中,過48小時后,造成MSCs缺氧的情況,用Ad5／F35腺病毒攜帶的增強型綠色熒光蛋白(EGFP)轉染液轉染,經過6小時的培養(yǎng),再其中加入相等量的L-DMEN,24小時后,放置于倒置顯微鏡下進行觀察。流式細胞儀分析MSCs表面CXCR4表達情況。2.探討不同途徑移植MSCs對阿霉素慢性腎病大鼠的影響。14周齡雄性SD大鼠72只隨機分為6組,各12只：①阿霉素模型對照組(ADR組)：通過手術的方法,將SD大鼠左側腎臟切除,之后,將4mg/kg劑量的阿霉素注射到大鼠尾靜脈中,術畢,麻醉過后待大鼠自然清醒,一周后再從尾靜脈給阿霉素1次(4mg/kg)。②假手術組(Sham組)：手術入路方式同ADR組,進入腹腔后分離左腎但不切除左腎,逐層縫合,術畢讓大鼠自然清醒,ADR注射阿霉素時Sham組以等量生理鹽水代替。③阿霉素造模+細胞經尾靜脈移植組(ADR+MSCs-V組)：末次注射阿霉素后第4周,MSCs (2×106/ml) 0.5ml經尾靜脈注射,第5周從尾靜脈再次注射MSCs0.5ml (2×106/ml)。④阿霉素造模+細胞經腎動脈移植組(ADR+MSCs-A組)：末次注射阿霉素后第4周,MSCs (2×106/ml) 0.5ml經腎動脈注射,第5周從腎動脈再次注射MSCs0.5ml (2×106/ml)。⑤Sham+尾靜脈注射MSCs組(Sham+MSCs-V組)：末次注射生理鹽水后第4周,MSCs (2×106/ml) 0.5ml經尾靜脈注射,第5周從尾靜脈再次注射MSCs0.5ml (2×106/ml). ⑥Sham+1腎動脈注射MSCs組(Sham+MSCs-A組)：末次注射生理鹽水后第4周,MSCs (2×106/ml) 0.5ml經腎動脈注射,第5周從腎動脈再次注射MSCs0.5ml (2×106/ml)。6組大鼠分別于末次細胞移植的第0周、移植后第1周、2周各組取4只大鼠,處死前收集24小時尿量,處死后收集血標本、腎臟、心臟、肝臟、骨髓,進行以下檢查：①血標本檢測血紅蛋白、腎功能(血尿素氮、血肌酐)、丙氨酸轉氨基酶(ALT)、天冬氨酸轉氨基酶(AST)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、血清白蛋白、血清鈉；②尿標本行24h尿蛋白定量檢測；③細胞移植后第2周,ADR組、Sham組、ADR+MSCs-V組、ADR+MSCs-A組大鼠腎組織均進行蘇木精-伊紅(HE)染色、六銨銀染色(PASM)、Masson染色,在光學顯微鏡下觀察腎組織形態(tài)學方面的變化；④ADR組、Sham組、ADR+MSCs-V組、ADR+MSCs-A組大鼠心臟、肝臟、骨髓均做病理切片,光學顯微鏡下觀察形態(tài)學改變。⑤免疫組化檢測ADR組、Sham組、ADR+MSCs-V組、ADR+MSCs-A組大鼠腎臟AQP1, AQP2的表達,電鏡觀察各組大鼠腎臟超微結構。3.14周齡雄性SD大鼠84只,隨機分為4組：ADR組,ADR+MSCs-V組、ADR+MSCs-A組每組各24只,Sham組12只。模型制備和MSCs用量同前,使用缺氧條件下培養(yǎng)并經EGFP轉染液轉染的MSCs。4組大鼠在MSCs移植后第1天、第7天、第14天,第30天,ADR組,ADR+MSCs-V組、ADR+MSCs-A組每組各取6只大鼠處死,Sham組取3只大鼠處死,處死后留腎臟,行以下檢測：①在激光共聚焦熒光顯微鏡下,對顯示綠色熒光的MSCs在腎臟中的分布情況進行具體的觀察；②Real-time PCR法檢測腎臟中SDF-1mRNA表達；③移植后第14天,Western-blotting檢測腎臟中SDF-1蛋白的水平。4. 14周齡雄性SD大鼠32只,隨機分為4組：ADR組,ADR+MSCs-A組,ADR+NS-A組,Sham組,各組8只。模型制備和MSCs用法用量同前,但ADR+MSCs-A組,ADR+NS-A組均采用經頸動脈途徑腎動脈插管方式行腎動脈造影,然后ADR+MSCs-A組再經插管予MSCs, ADR+NS-A組則經插管予等量生理鹽水(NS)替代MSCs。4組大鼠分別于末次細胞移植后的第1天、第7天各取4只大鼠處死,留血標本和腎臟,行以下檢測：①血標本檢測血常規(guī),以及同時檢測血肌酐與血清尿素氮；②觀察4組大鼠的腎臟組織在光學顯微鏡下形態(tài)學發(fā)生的變化。結果1.經過酶作用消化后的原代細胞在24-48小時的時間內發(fā)生貼壁的情況,1周之后生長速度較快,以平行排列方式進行增長,在第2、第3周后能夠形成70%融合的貼壁細胞層,反復傳代后獲得形態(tài)均一的細胞,呈梭形,流式細胞儀檢測細胞表型發(fā)現細胞表達CD29、CD44、CD90等MSCs標記物,不表達CD45及CD11b。P2代細胞成骨定向需要誘導14天,后可以看見細胞之間有黑色細小顆粒,該現象提示了有礦化基質的沉積,成脂肪定向誘導需要14天,后表現出油紅-O染色強陽性。P4代細胞生長速度快,放置于2%O2、5% CO2、93%N2的環(huán)境中,48小時后,細胞缺氧的情況發(fā)生,Ad5／F35腺病毒攜帶的增強型綠色熒光蛋白(EGFP)轉染液進行轉染,之后需要培養(yǎng)6小時,再加等容量的L-DMEN,經過24小時后,在倒置顯微鏡下細致觀察熒光表達情況,發(fā)現綠色熒光表達率為75%,其表現出來的形態(tài)和正常的培養(yǎng)細胞并無明顯差別。正常培養(yǎng)的BMSCs表面CXCR4表達很弱,缺氧條件下培養(yǎng)的BMSCs表面的CXCR4表達明顯增強。2.①各時間點Sham+MSCs-V組、Sham+MSCs-A組的體重增長、血紅蛋白、血尿素氮、血肌酐水平與Sham比較沒有顯著差異(P0.05)。②各時間點ADR組、ADR+MSCs-V組、ADR+MSCs-A組的腎功能(血尿素氮、血肌酐)、24h尿蛋白定量明顯高于Sham組(P0.05)。末次注射干細胞的第0周,與ADR組比較,ADR+MSCs-A組的24h尿微量蛋白降低(P0.01)。末次注射干細胞后第1周,ADR+MSCs-A組的血肌酐較ADR組和ADR+MSCs-V組均降低 (P0.01),且24 h尿蛋白、24 h尿微量蛋白明顯低于ADR+MSCs-V組(P0.01)：第2周時,盡管ADR+MSCs-A組的血肌酐較ADR組降低(P0.01),但與ADR+MSCs-V組之間的差異不再明顯。③ADR+MSCs-A組和ADR+MSCs-V組大鼠的血清白蛋白水平和24h尿量較ADR組有明顯提高(P0.05),而血清鈉濃度和24h尿蛋白定量較ADR組有明顯降低(血清鈉：P0.05；24h尿蛋白定量：P0.01)。以上檢測指標在ADR+MSCs-A組和ADR+MSCs-V組之間無顯著差異。④Sham組腎臟的腎小球、腎間質、腎小管沒有表現出明顯的病變情況。ADR組腎臟的腎小管、腎小球、腎間質均有不同程度受損。ADR+MSCs-A組和ADR+MSCs-V組在腎間質炎癥病理改變上較ADR組程度上更輕,范圍更小。⑤與ADR組比較,ADR+MSCs-A組和ADR+MSCs-V組大鼠的血清白蛋白濃度和24h尿量增加(P0.05),血清鈉濃度和24h尿蛋白定量降低(P0.05),腎臟AQP1、AQP2的表達明顯降低(P0.05),ADR組大鼠腎臟超微結構呈現退行性變,MSCs移植改善了其超微結構。3.①GFP標記的MSCs移植后1天,在ADR+MSCs-V組發(fā)現分布在腎小管,在ADR+MSCs-A組除了腎小管之外,腎小球也有少量分布。之后逐漸增加,14天時最明顯;②ADR組大鼠腎組織內SDF-1表達較Sham組明顯增加(P0.05),并隨著時間推移而逐漸增加；③經缺氧培養(yǎng)的異體骨髓MSCs移植后,SDF-1表達較ADR組降低,在14d有統(tǒng)計學意義(P0.05),但ADR+MSCs-A組和ADR+MSCs-V組之間無顯著差異。4.①第1天時,與ADR組比較,ADR+MSCs-A組、ADR+NS-A組的腎功能指標和血紅蛋白含量均無明顯差異(P0.05)：第7天時,與ADR組比較,ADR+NS-A組的腎功能指標和血紅蛋白含量仍無明顯差異(P0.05),但ADR+MSCs-A組的血尿素氮和血肌酐明顯降低(P0.05),血紅蛋白含量明顯升高(P0.05)。②光鏡下大鼠腎臟病理顯示,與ADR組比較,ADR+NS-A組腎小球、腎小管、腎間質損傷程度與ADR組相當,但ADR+MSCs-A組在腎間質炎癥病理改變的程度上更輕,范圍更小。結論1.培養(yǎng)的細胞為骨髓間充質干細胞,符合干細胞特征。在缺氧條件下培養(yǎng),細胞表面CXCR4表達增加。2.同種骨髓間充質干細胞移植是安全的,在移植后一段時間內,MSCs經腎動脈移植的效果優(yōu)于經外周靜脈移植。MSCs移植可降低大鼠尿蛋白排泄,提高血清白蛋白水平,降低血鈉水平,下調AQP1、AQP2的過度表達,從而保護了腎臟。3.在阿霉素慢性腎病大鼠腎組織內,SDF-1表達增加可能與骨髓間充質干細胞遷移增加有一定關系；骨髓間充質干細胞治療阿霉素腎病的機制還有待進一步研究。4.腎動脈造影并移植間充質干細胞有利于慢性腎衰大鼠腎臟損傷的修復,該方法可以模擬臨床介入腎動脈移植干細胞的方式,在實驗研究中可以應用推廣。
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【學位授予單位】：昆明醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R692

【參考文獻】

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