本文關(guān)鍵詞： 內(nèi)皮祖細胞 內(nèi)源性神經(jīng)干細胞 共培養(yǎng) 脊髓損傷　出處：《安徽醫(yī)科大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：利用神經(jīng)干細胞(neural stem cells, NSCs)修復(fù)脊髓損傷(spinal cord injury, SCI)的實驗研究主要有兩種方法。一種方法是通過移植外源性NSCs到損傷部位,通過外源性NSCs的增殖和分化,替代因損傷而缺失的神經(jīng)元細胞,重建神經(jīng)通路從而修復(fù)損傷脊髓；另一種方法是通過各種手段誘導(dǎo)損傷部位的脊髓內(nèi)源性NSCs增殖和分化,替代因損傷而缺失的神經(jīng)元細胞,重建神經(jīng)通路來修復(fù)損傷脊髓。當(dāng)前的研究表明將外源性NSCs移植到損傷部位實質(zhì)上只是改善了損傷部位局部的內(nèi)環(huán)境,最終還是通過脊髓內(nèi)環(huán)境的改善從而誘導(dǎo)和促進脊髓內(nèi)源性NSCs的神經(jīng)生發(fā)來修復(fù)損傷脊髓。神經(jīng)生發(fā)往往伴隨著血管生發(fā),提示血管因素在神經(jīng)損傷修復(fù)的過程中占有重要的地位,有效的血管生發(fā)應(yīng)該能帶來脊髓微環(huán)境的明顯改善,從而誘導(dǎo)損傷部位的神經(jīng)生發(fā)。內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cells, EPCs)是一種能夠在外周血中分離培養(yǎng)獲得,能有效促進組織血管生發(fā)的干細胞。本實驗設(shè)計分離培養(yǎng)SD大鼠外周血的EPCs并移植入SCI大鼠的損傷脊髓,通過改善損傷脊髓內(nèi)環(huán)境誘導(dǎo)內(nèi)源性NSCs的神經(jīng)生發(fā)重建神經(jīng)通路以修復(fù)損傷脊髓。研究首先分離培養(yǎng)大鼠外周血EPCs和脊髓內(nèi)源性NSCs,然后在體外進行外周血EPCs與脊髓內(nèi)源性NSCs的共培養(yǎng),通過倒置顯微鏡觀察和免疫組化方法鑒定外周血EPCs對脊髓內(nèi)源性NSCs增殖與分化情況的影響并測定培養(yǎng)上清液的血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)的表達變化,研究其機制。接著將外周血EPCs移植入SCI大鼠模型的損傷部位,通過BBB評分、Rivlin斜扳試驗觀察SCI的恢復(fù)情況,通過組織學(xué)觀察神經(jīng)元再生情況、免疫熒光染色的方法觀察脊髓內(nèi)源性NSCs的增殖分化情況,鑒定EPCs對神經(jīng)生發(fā)的促進作用,測定損傷脊髓VEGF的表達變化反映外周血EPCs對脊髓神經(jīng)功能的修復(fù)的作用機制。為實現(xiàn)白體外周血EPCs誘導(dǎo)脊髓內(nèi)源性NSCs生發(fā)有效修復(fù)SCI的臨床應(yīng)用打下研究基礎(chǔ)。本研究分四個部分,在實驗一中取5-7 d的SPF級新生SD大鼠,頸椎脫臼法處死,無菌條件下取出胸腰段脊髓組織,去除血管和軟脊膜等多余組織后將其剪碎,過濾,離心,分離,并用NSCs培養(yǎng)液成功分離培養(yǎng)出懸浮生長的細胞球,經(jīng)免疫組化鑒定能表達NSCs的特異性抗原Nestin,加入血清繼續(xù)培養(yǎng)后能分化為帶有軸突和樹突的細胞,經(jīng)免疫組化鑒定能表達神經(jīng)元特異性抗原β-tubulin-Ⅲ,即為神經(jīng)元,ELISA測定其培養(yǎng)7d上清液可見VEGF和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)表達,說明該分離培養(yǎng)的細胞可以確定為大鼠脊髓內(nèi)源性NSCs,并能分泌VEGF和BDNF。在實驗二中取體重為90-120 g的雄性SPF級SD大鼠行10%水合氯醛(0.3ml/100 g)腹腔麻醉,麻醉滿意后在無菌條件下取頸部正中切口,剪開皮膚及皮下組織向兩邊翻開并固定,沿肌肉間隙仔細分離至暴露雙層頸動脈,然后用無菌采血管取雙側(cè)頸動脈的血液,約10 ml,取血完成后立即轉(zhuǎn)入超凈工作臺中,按照淋巴細胞分離液試劑盒的操作說明分離出單個核細胞層,離心洗滌細胞,所獲得的細胞沉淀以EBM-2完全培養(yǎng)基重懸,以5×105/ml細胞濃度接種到含有預(yù)先FN包被過的蓋玻片的24孔板中,37℃,5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。約9d左右,細胞融合度達到約90%后傳代。細胞形態(tài)鏡下觀察符合文獻報道的鋪路石樣排列。經(jīng)免疫組化鑒定能表達細胞表面抗原CD133及VEGFR-2,攝取Dil-Ac-LDL和結(jié)合FITC-UEA-1雙陽性,說明成功分離培養(yǎng)出大鼠外周血EPCs。ELISA測定其培養(yǎng)7d上清液可見VEGF大量表達、BDNF少量表達,說明大鼠外周血EPCs可以大量分泌VEGF。在實驗三中將實驗對象隨機分為NSCs培養(yǎng)對照組,EPCs與NSCs共培養(yǎng)組和抗VEGF組(加入VEGF抗體的EPCs與NSCs共培養(yǎng)組)。NSCs培養(yǎng)對照組：收集純化后培養(yǎng)的第3代NSCs,吹打成單細胞懸液后接種于24孔培養(yǎng)板培養(yǎng)7 d,觀察其生長情況,然后用5%血清誘導(dǎo)培養(yǎng)NSCs7天,觀察其分化情況。EPCs和NSCs共培養(yǎng)組：在對照組的基礎(chǔ)上在孔內(nèi)放置24孔板Transwell,取載有貼壁原代生長良好EPCs蓋玻片,EPCs置于Transwell膜上,NSCs位于Transwell膜下,培養(yǎng)7 d,觀察NSCs生長情況,然后移走EPCs及Transwell膜,加5%血清誘導(dǎo)繼續(xù)培養(yǎng)NSCs 7 d,觀察其分化情況�？筕EGF組：在EPCs和NSCs共培養(yǎng)組的基礎(chǔ)上再培養(yǎng)液內(nèi)加入VEGF抗體(200 pg/ml),培養(yǎng)7 d,觀察NSCs生長情況,然后移走EPCs及Transwell膜,加5%血清誘導(dǎo)繼續(xù)培養(yǎng)NSCs 7 d,觀察其分化情況。結(jié)果在倒置顯微鏡下觀察可見7d時,共培養(yǎng)組神經(jīng)球數(shù)量比對照組明顯多,而且球直徑明顯增大,共培養(yǎng)組與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；5%血清誘導(dǎo)培養(yǎng)NSCs7天后,行β-tubulin-Ⅲ免疫熒光染色,在顯微鏡下計算β-tubulin-Ⅲ+/細胞總數(shù)得出百分率,共培養(yǎng)組明顯高于對照組(P0.05)。ELISA法檢測各組培養(yǎng)7d上清液VEGF水平,發(fā)現(xiàn)抗VEGF組的VEGF表達明顯低于共培養(yǎng)組(P0.05),而誘導(dǎo)NSCs的增殖分化能力也顯著降低(P0.05)。說明外周血EPCs在體外能明顯促進脊髓源性NSCs的增殖與分化并與EPCs分泌VEGF有關(guān)。在實驗四中我們將4月齡的SPF級SD大鼠隨機分為EPCs移植組,NSCs移植組和對照組,每組24只。術(shù)前三天至術(shù)后一周每天BrdU(50μg/g)腹腔注射,采用改良Allen's法制備大鼠SCI模型后,EPCs移植組應(yīng)用Hamilton微量注射器在SCI處近端約0.5～1.0mm向脊髓內(nèi)注入EPCs 5μl,細胞總數(shù)5×105/ml。NSCs移植組應(yīng)用Hamilton微量注射器在SCI處近端約0.5～1.0mm向脊髓內(nèi)注入NSCs 5μl,細胞總數(shù)5×105/ml。對照組應(yīng)用Hamilton微量注射器在SCI處近端約0.5～1.0mm向脊髓內(nèi)注入生理鹽水5μl。在術(shù)后1、2、4、6周采用BBB運動功能評分系統(tǒng),Rivlin斜板運動試驗檢測大鼠運動功能恢復(fù)情況；采用組織學(xué)觀察和免疫熒光雙標(biāo)染色檢測脊髓組織病理變化情況以及EPCs對內(nèi)源性NSCs增殖分化的影響；ELISA試驗檢測各組脊髓組織VEGF表達的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),手術(shù)后2、4、6周運動功能評分EPCs移植組BBB評分明顯高于NSCs移植組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。組織學(xué)觀察示EPCs移植組脊髓結(jié)構(gòu)以及神經(jīng)元形態(tài)恢復(fù)較好且逐漸趨于正常,免疫熒光雙標(biāo)染色示EPCs移植組脊髓組織中BrdU+/MAP-2+細胞數(shù)較NSCs移植組明顯增多,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),ELISA試驗發(fā)現(xiàn)EPCs移植組脊髓組織中VEGF表達明顯高于NSCs移植組(P0.05)。這些結(jié)果提示EPCs能夠在體內(nèi)環(huán)境中誘導(dǎo)內(nèi)源性NSCs增殖和分化從而促進SCI大鼠運動功能的恢復(fù)并且優(yōu)于NSCs移植。該作用可能與EPCs移植后通過VEGF分泌改善SCI微環(huán)境有關(guān)。綜上所述,本實驗成功在大鼠脊髓組織提取脊髓內(nèi)源性NSCs和在外周血中分離出EPCs,外周血EPCs在體外能通過VEGF明顯促進脊髓內(nèi)源性NSCs增殖和分化。在SCI大鼠中移植EPCs能夠誘導(dǎo)脊髓內(nèi)源性NSCs增殖和分化,促進SCI大鼠運動功能的恢復(fù)并優(yōu)于NSCs移植,該作用可能與EPCs移植后VEGF分泌的增加改善SCI微環(huán)境有關(guān)。
[Abstract]:In order to study the effect of EPCs on the proliferation and differentiation of spinal cord injured spinal cord ( SCI ) , the effect of EPCs on the proliferation and differentiation of endogenous neural stem cells in spinal cord was studied by means of reversed microscopic observation and immunohistochemical method . The expression of VEGF and brain - derived neurotrophic factor ( BDNF ) in peripheral blood of rats were determined by immunohistochemistry . The expression of VEGF in the spinal cord was significantly higher than that in the control group ( P0.05 ) . The results showed that the VEGF expression of the group was significantly higher than that in the control group ( P0.05 ) .

【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R651.2

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本文編號：1536606