本文關(guān)鍵詞： 經(jīng)皮冠狀動脈介入治療 再狹窄 抗血管緊張素Ⅱ1型受體自身抗體 內(nèi)皮祖細(xì)胞 凋亡 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激　出處：《山西醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景:近年來,冠心病的發(fā)病呈逐年上升且低齡化的傾向,已成為我國重大的公共衛(wèi)生問題。經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(Percutaneous Coronary Intervention,PCI)是目前冠心病血運恢復(fù)的重要臨床手段。中國接受PCI治療人數(shù)的逐年增加,年平均增長率在10%-15%,但PCI術(shù)后再狹窄嚴(yán)重限制了血運重建的遠(yuǎn)期效果,即便隨著新一代DES廣泛應(yīng)用,再狹窄率仍高達(dá)12%,因此關(guān)于再狹窄的研究一直是近年的熱點。PCI術(shù)后再狹窄的本質(zhì)是血管內(nèi)膜損傷部位組織的過度愈合反應(yīng),導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞增殖、遷移和細(xì)胞基質(zhì)沉積使新生內(nèi)膜過度增生所致,內(nèi)皮損傷是引起血管再狹窄的始動因素及主要環(huán)節(jié),加速局部內(nèi)皮化,促進(jìn)內(nèi)皮快速修復(fù)可降低再狹窄,而內(nèi)皮修復(fù)延遲,則可導(dǎo)致再狹窄的發(fā)生。內(nèi)皮是如何修復(fù)的呢?傳統(tǒng)的觀點認(rèn)為血管內(nèi)皮損傷后主要通過循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖來修復(fù)損傷血管,至20世紀(jì)末,研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endothelial progenitor cells,EPCs)才真正是損傷的血管再內(nèi)皮化的重要細(xì)胞來源。EPCs由骨髓干細(xì)胞衍生,在生理或病理因素刺激下,可由骨髓動員到外周血,歸巢于損傷部位,并增殖分化為內(nèi)皮細(xì)胞,促進(jìn)損傷血管內(nèi)皮的修復(fù)。PCI致血管損傷后EPCs可快速動員然后定植于損傷部位,加速再內(nèi)皮化,從而有效減少平滑肌細(xì)胞增殖,抑制內(nèi)膜的過度增生。已有研究證實PCI術(shù)后再狹窄患者外周血中無論EPCs數(shù)量、還是其增殖能力、遷移能力均顯著降低。所以,PCI術(shù)后再狹窄形成的進(jìn)程中,EPCs數(shù)目減低或/和功能下降或是支架術(shù)后再狹窄的關(guān)鍵因素所在。血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)最主要的生物學(xué)活性分子,其在促進(jìn)細(xì)胞分化、增殖、生長及調(diào)節(jié)血管張力、血容量方面均有重要作用。多項研究顯示AngⅡ可以促進(jìn)EPCs凋亡,減少其數(shù)量,引起EPCs功能下降,而阻斷AngⅡ后可以明顯減少EPCs凋亡數(shù)量,改善其功能,其機(jī)制主要是促進(jìn)活性氧的生成,誘發(fā)機(jī)體的氧化應(yīng)激、降低端粒酶活性,加速EPCs衰老和凋亡,而此作用可被纈沙坦阻斷。近年國內(nèi)外一些研究在惡性高血壓、先兆子癇、腎移植等患者血清中均發(fā)現(xiàn)了抗AT1R的自身抗體(Angiotensin II type 1 Receptor Autoantibodies,AT1-AA)的存在,其可通過專一識別結(jié)合AT1受體的細(xì)胞外第二環(huán)功能表位肽段(the second extracellular loop of the angiotensin II type 1 receptor,AT1R-ECⅡ),激活A(yù)T1受體,產(chǎn)生與AngⅡ激活A(yù)T1R相類似的生物學(xué)效應(yīng)。目前,AT1-AA在PCI術(shù)后支架再狹窄方面的研究還處于初期階段,AT1-AA是否會導(dǎo)致支架再狹窄,是否通過影響EPCs而發(fā)揮作用,通過何種機(jī)制尚不清楚。本文將對以上幾個方面問題進(jìn)行研究。第一部分:AT1受體自身抗體滴度與冠脈支架植入術(shù)后再狹窄的關(guān)系分析目的:在惡性高血壓、先兆子癇、腎移植患者血清中可檢測到抗血管緊張素Ⅱ1型受體自身抗體(AT1-AA)的存在,該自身抗體可激活A(yù)T1受體,與AngⅡ激活A(yù)T1R產(chǎn)生相類似的生物學(xué)效應(yīng)。我們將探討冠脈支架植入術(shù)后再狹窄與AT1-AA的關(guān)系。方法:根據(jù)PCI術(shù)后患者冠脈造影復(fù)查結(jié)果是否發(fā)生支架再狹窄分為再狹窄組和非再狹窄組(分別為50例和60例),同時設(shè)置冠心病組(已行冠脈造影但未植入支架,60例),對照組(行冠脈造影排外冠心病者,40例),均除外急性心肌梗死,且四組患者性別、年齡、冠心病危險因素(包括高血壓、高血脂、糖尿病、吸煙等)、藥物服用情況及支架植入情況(再狹窄組和非再狹窄組比較)等基線特征差異無統(tǒng)計學(xué)意義,均臥位采靜脈血10ml,采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)對標(biāo)本血清進(jìn)行AT1-AA檢測,相同方法檢測AngⅡ,比較各組間AT1-AA的OD值及陽性率,以及AngⅡ濃度的差別。另選擇門診年輕健康的體檢者15例留靜脈血做AT1-AA檢測的陰性對照。結(jié)果:再狹窄組AT1-AA陽性率(62.0%,31例陽性/50例),明顯高于非再狹窄組(35.0%,21例陽性/60例)、冠心病組(16.7%,10例陽性/60例)、對照組(7.5%,3例陽性/40例),差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),再狹窄組OD值與非再狹窄組、冠心病組、對照組比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),非再狹窄組的雖低于再狹窄組,但是與冠心病組及對照組比較,陽性率和OD值偏高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),冠心病組與對照組比較,冠心病組的陽性率及OD值略高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。再狹窄組與非再狹窄組比較AngⅡ差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);再狹窄組、非再狹窄組與冠心病組比較,再狹窄組與非再狹窄組略高,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);再狹窄組、非再狹窄組與對照組比較,再狹窄組與非再狹窄組較高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);冠心病組與對照組比較,冠心病組略高,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:1.支架再狹窄組與非再狹窄相比AT1-AA較高,提示AT1-AA可能對PCI術(shù)后再狹窄有影響。2.與未植入冠脈支架組相比,植入支架兩組的AT1-AA較高,提示PCI過程可能導(dǎo)致AT1-AA升高。第二部分:AT1受體自身抗體與動物血管損傷后修復(fù)狀況的研究目的:首先主動免疫大鼠產(chǎn)生AT1-AA,然后行球囊損傷大鼠頸總動脈,并觀察AT1-AA對損傷血管修復(fù)的影響。方法:1.分組:55只大鼠分為4組,A組為AT1-AA組+球囊損傷組,15只,B組為AT1-AA+纈沙坦組+球囊損傷組,15只,C組為單純球囊損傷組,20只,D組為正常對照組,5只。2.主動免疫:AT1多肽與載體偶聯(lián)得到完全抗原,與弗氏完全佐劑混勻乳化后以0.4ug/kg的AT1多肽量于大鼠背部多點皮下注射,對A組、B組進(jìn)行主動免疫,C組及D組采用等量弗氏完全佐劑大鼠背部多點皮下注射,后每2周對A組、B組進(jìn)行進(jìn)行一次強(qiáng)化免疫,采用AT1多肽偶聯(lián)物與弗氏不完全佐劑乳化。3.對B組即AT1-AA+纈沙坦+球囊損傷組自首次免疫開始以2mg/kg/d纈沙坦灌胃至處死。4.大鼠血清AT1-AA的檢測:A組、B組大鼠在主動免疫開始前、之后2周、4周、6周、8周、10周時眼眶采血,應(yīng)用ELISA法檢測大鼠體內(nèi)的AT1-AA滴度。5.于主動免疫6周時建立大鼠左頸總動脈球囊損傷的模型:麻醉大鼠,手術(shù)切開分離頸部皮膚和組織,暴露其左頸總動脈、頸外動脈、頸內(nèi)動脈,自頸外動脈送入經(jīng)修剪的PTCA導(dǎo)絲及1.5*8mm PTCA球囊至左頸總動脈,加壓球囊,并來回抽動,損傷血管內(nèi)膜。以上為A組、B組和C組的操作,D組為正常對照組。6.標(biāo)本取材,處理:D組為正常對照組,5只大鼠于麻醉后解剖分離血管,取出左頸總動脈,大鼠追加麻藥致死,左頸總動脈用0.9%氯化鈉溶液沖洗管腔,分為3段,分別進(jìn)行HE染色、電鏡檢查、熒光定量PCR(RT-PCR)測定一氧化氮合酶(e NOS)m RNA,以做基礎(chǔ)參照。C組中5只大鼠擬觀察損傷后即刻情況,于球囊損傷后立即取出受損的左頸總動脈,大鼠追加麻藥致死,取出左頸總動脈為球囊損傷即刻標(biāo)本,沖洗后處理同上。A組、B組各15只和C組中剩余15只大鼠,于造模后7天、2周、4周分3批處死大鼠,每組每次5只,取出左頸總動脈(同時取出右側(cè)頸總動脈做對照),沖洗后處理同上。。6.1 HE染色觀察染色結(jié)果,測定平均內(nèi)膜面積(IA)、中膜面積(MA)、管腔面積(LA),計算IA/MA,管腔狹窄率[1-(左頸總動脈管腔面積/右頸總動脈管腔面積)]。6.2掃描電鏡檢查將標(biāo)本沿縱向剖開,經(jīng)戊二醛和鋨酸雙重固定、梯度乙醇脫水、醋酸正(異)戊酯置換后,于臨界點干燥,經(jīng)離子濺射噴金后用S-3500N型掃描電子顯微鏡掃描觀察,測定內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋情況。6.3應(yīng)用實時熒光定量PCR(RT-PCR)測定一氧化氮合酶(e NOS)m RNA將組織研磨后經(jīng)RNA提取、反轉(zhuǎn)錄c DNA、熒光定量PCR,由PCR反應(yīng)曲線所得的Ct值,采用△△Ct方法進(jìn)行相對定量。結(jié)果:(1)大鼠ATI-AA的滴度A組、B組大鼠主動免疫前靜脈血中未檢出AT1-AA,主動免疫2周時,在靜脈血中可檢出AT1-AA,滴度為1:(250±82.3),4周、6周、8周的滴度逐漸升高,10周滴度為1:(7000±2340.5),6周、8周、10周的AT1-AA滴度與2周時相比有顯著差異(P0.01),提示主動免疫成功。(2)HE染色結(jié)果球囊損傷即刻,觀察到內(nèi)皮細(xì)胞完全剝脫。至損傷1周時,AT1-AA+球囊損傷組、AT1-AA+纈沙坦+球囊損傷組、單純球囊損傷組均觀察到新生血管內(nèi)膜形成,管腔則輕度變窄,但三組內(nèi)膜面積(IA),中膜面積(MA),IA/MA,LA(管腔面積)無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),2周時,鏡下三組內(nèi)膜增厚較前明顯,其中可見較多增生遷移至此的平滑肌細(xì)胞,管腔變小,三組中AT1-AA+球囊損傷組IA,IA/MA最高,LA最小,AT1-AA+纈沙坦+球囊損傷組次之,單純球囊損傷組最輕,比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),中膜差別不大。損傷4周時,各組差異更加明顯,AT1-AA+球囊損傷組IA達(dá)到了0.914±0.024 mm2,IA/MA 4.562±0.032,LA為0.048±0.023mm2,而單純球囊損傷組內(nèi)膜增生最輕,IA為0.336±0.027 mm2,IA/MA 1.504±0.030,LA 0.138±0.026 mm2,兩組比較有顯著性差異(P0.01),AT1-AA+球囊損傷組與AT1-AA+纈沙坦+球囊損傷組有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),三組MA比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。各時間點每只大鼠取材時所取右側(cè)頸總動脈標(biāo)本行HE染色,測算平均管腔面積,計算狹窄率[1-(左頸總動脈管腔面積/右頸總動脈管腔面積)]。損傷1周、2周時,AT1-AA+球囊損傷組、AT1-AA+纈沙坦+球囊損傷組、單純球囊損傷組狹窄率比較無統(tǒng)計學(xué)意義,4周時三組的狹窄率分別為70.4%,61.8%,52.3%,比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),其與上IA,IA/MA,LA指標(biāo)三組比較的結(jié)果類似。綜上,AT1-AA+球囊損傷組、AT1-AA+纈沙坦+球囊損傷組、單純球囊損傷組三組球囊損傷后新生內(nèi)膜會逐漸增生修復(fù),三組2周時差異顯現(xiàn),4周時差異顯著,AT1-AA+球囊損傷組新生內(nèi)膜增生最為明顯,管腔面積最小,狹窄率最高,加入纈沙坦組上述狀況改善明顯,單純球囊損傷組新生內(nèi)膜增生最輕,管腔面積最大,狹窄率最低。提示AT1-AA可使受損血管新生內(nèi)膜明顯增厚,管腔變小,狹窄程度增高,而纈沙坦可部分改善此狀況。(3)電鏡結(jié)果在每個組織標(biāo)本中隨機(jī)取5個視野(1.0k)計數(shù)內(nèi)皮細(xì)胞后取平均值。在1.0k和3.0k的視野中可觀察到球囊處理前后內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)量發(fā)生明顯變化,經(jīng)球囊處理后內(nèi)皮細(xì)胞基本消失,證實球囊損傷的比較徹底。在1.0k視野下,可觀察到三組內(nèi)皮細(xì)胞的修復(fù)過程,隨著時間推移,各組視野內(nèi)的內(nèi)皮細(xì)胞逐漸增多,內(nèi)皮細(xì)胞計數(shù)發(fā)現(xiàn),損傷1周、2周時,三組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);到4周時,單純球囊損傷組計數(shù)最多,為(46±3.9)個,AT1-AA+纈沙坦+球囊損傷組計數(shù)為(36±5.6),AT1-AA+球囊損傷組計數(shù)為(30±2.7)個,單純球囊損傷組與AT1-AA+球囊損傷組和AT1-AA+纈沙坦+球囊損傷組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),AT1-AA+纈沙坦+球囊損傷組與AT1-AA+球囊損傷組相比亦有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),提示單純球囊組內(nèi)皮修復(fù)最快,AT1-AA+球囊損傷組修復(fù)最慢,加入纈沙坦,內(nèi)皮修復(fù)改善,可能與纈沙坦拮抗AT1受體,從而抑制了AT1-AA的效應(yīng)有關(guān)。行右側(cè)頸總動脈內(nèi)皮細(xì)胞計數(shù)作為參照,計算1周、2周、4周時的內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋率(左頸總動脈內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)/右頸總動脈內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)),1周、2周時三組比較差異仍無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),4周時,AT-AA+球囊損傷組為64.2%,AT-AA+纈沙坦+球囊損傷組為72.3%,單純球囊組為92.7%,三組兩兩比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋率與內(nèi)皮細(xì)胞計數(shù)所得出的結(jié)論是一致的。(4)熒光定量PCR檢測e NOSm RNA結(jié)果在球囊損傷即刻,損傷組e NOSm RNA的2-△CT值與正常對照組(未行球囊損傷血管)比較明顯減低,球囊損傷后1周時,A組(AT1-AA組+球囊損傷組),B組(AT1-AA+纈沙坦組+球囊損傷組),C組(單純球囊損傷組)三組2-△CT值仍處于較低水平,隨著時間推移,各組e NOSm RNA逐漸回升,C組升高較快,A組恢復(fù)較慢,4周時,三組差異明顯,其中C組最高,A組最低,B組居中,C組與A組,B組比較均有顯著差異,B組與A組比較也有統(tǒng)計學(xué)意義,A,B,C三組球囊損傷4周時e NOSm RNA與正常對照相比的相對表達(dá)量(2-△△CT),C組最高,為0.547,仍未達(dá)到正常水平,A組最低,B組居中,提示AT1-AA對e NOSm RNA表達(dá)水平的有影響,可使其恢復(fù)延緩,而在AT1-AA基礎(chǔ)上給予纈沙坦阻斷AT1-AA作用可使這種延緩狀況得到改善。結(jié)論:1.AT1-AA作用于受損血管可使新生內(nèi)膜明顯增厚,管腔變小,從而導(dǎo)致再狹窄,而纈沙坦可明顯改善此狀況;2.基于各組掃描電鏡內(nèi)皮細(xì)胞計數(shù)和計算內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋率的差異及e NOS恢復(fù)的差異,提示AT1-AA可導(dǎo)致內(nèi)皮修復(fù)延遲;3.再次證實內(nèi)皮修復(fù)延遲可使新生內(nèi)膜增厚明顯,與再狹窄發(fā)生密切相關(guān)。第三部分:體外實驗AT1-AA對EPCs的影響目的:已知EPCs參與受損內(nèi)皮的修復(fù)過程,EPCs損害會導(dǎo)致內(nèi)皮修復(fù)延遲,最終導(dǎo)致再狹窄。研究提示AngⅡ可以促進(jìn)EPCs的衰老和凋亡增加,導(dǎo)致其功能下降,AT1-AA與AngⅡ作用類似,但AT1-AA對EPCs影響的研究目前較少,本部分?jǐn)M行體外實驗,觀察AT1-AA對EPCs的影響及機(jī)制。方法:1.MTT法檢測EPCs生存活力:應(yīng)用2.5、5和10μM的AT1-AA處理細(xì)胞EPCs24 h,或10μM的AT1-AA處理EPCs3、6、9、12和24 h,MTT法檢測細(xì)胞生存活力檢測,再加入纈沙坦檢測。2.DAPI染色檢測EPCs凋亡情況(2.5、5和10μM)AT1-AA和1μM纈沙坦單獨或復(fù)合處理細(xì)胞,DAPI常溫染色,激光共聚焦電子顯微鏡觀察細(xì)胞核情況。通過觀察20個不同視野計算凋亡小體數(shù)獲得細(xì)胞凋亡率。3.流式細(xì)胞檢測測定EPCs凋亡情況Annexin-V/PI雙染法檢測EPCs凋亡情況。(2.5、5和10μM)AT1-AA和1μM纈沙坦單獨或復(fù)合處理EPCs,用緩沖液(含5μL Annexin V-FITC和2.5μL PI)重新懸浮細(xì)胞,細(xì)胞流式儀測定EPCs凋亡情況。4.活性氧(ROS)水平檢測CM-H2DCFDA細(xì)胞滲透劑檢測細(xì)胞ROS情況。纈沙坦(1μM)預(yù)處理EPCs后再與AT1-AA(10μM)孵育,后細(xì)胞用DCF-DA(20μM)孵育,使用激發(fā)波長488 nm、發(fā)射波長530 nm熒光光譜儀檢測細(xì)胞ROS水平。5.細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度檢測Fluo-4 AM染色檢測EPCs內(nèi)鈣離子濃度。EPCs中加入纈沙坦(1μM)及AT1-AA(10μM)孵育12 h后再加入Fluo-4 AM 25°C孵育30 min,使用激發(fā)波長488 nm、發(fā)射波長522 nm熒光光譜儀檢測細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度。6.鈣蛋白酶活性檢測EPCs細(xì)胞接種到24孔培養(yǎng)板中,用鈣螯合劑(BAPT)或鈣蛋白酶抑制劑(calpeptin)處理EPCs1 h,用加入鈣蛋白酶底物(40M)的培養(yǎng)基培養(yǎng),使用激發(fā)波長360 nm、發(fā)射波長460 nm熒光光譜儀檢測細(xì)胞內(nèi)鈣蛋白酶活性。7.蛋白免疫印跡Western blot檢測細(xì)胞p-ERK,p-e IF-2α,CHOP,Bcl-2和Caspase-3蛋白表達(dá)。步驟:1做樣,2 SDS-PAGE凝膠電泳,3蛋白轉(zhuǎn)膜,4接抗體,5顯影。結(jié)果:1.1 AT1-AA可誘導(dǎo)的EPCs生存活力的降低。首先研究AT1-AA對EPCs生存活力的影響。EPCs用2.5、5和10μM的AT1-AA處理24h,或10μM的AT1-AA處理3、6、9、12和24h。結(jié)果顯示AT1-AA能抑制EPCs細(xì)胞的生存活力,并存在劑量與時間上的依賴。同時,AT1-AA有效處理條件(10μM處理12h)被選擇作為進(jìn)一步研究的條件。然后纈沙坦(0.5、1和2μM)預(yù)處理細(xì)胞24h或1μM預(yù)處理細(xì)胞2、4、6、8、12和24h,同樣獲得纈沙坦的有效處理條件(1μM處理4h)。結(jié)果表明,AT1-AA處理EPCs細(xì)胞,明顯降低了EPCs細(xì)胞的生存活力,而且,纈沙坦預(yù)處理細(xì)胞后,明顯拮抗了AT1-AA誘導(dǎo)的EPCs細(xì)胞生存活力的降低。以上結(jié)果表明,AT1-AA可誘導(dǎo)EPCs生存活力的降低,該效應(yīng)可被纈沙坦抑制。1.2 AT1-AA可誘導(dǎo)的EPCs凋亡及纈沙坦的保護(hù)效應(yīng)。為探究AT1-AA誘導(dǎo)的EPCs生存活力的降低是否與細(xì)胞凋亡相關(guān)及纈沙坦對其的影響,以(2.5、5和10μM)AT1-AA和(1μM)纈沙坦單獨或復(fù)合處理內(nèi)皮祖細(xì)胞,DAPI染色和細(xì)胞流式檢測細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示,AT1-AA處理細(xì)胞后,EPCs細(xì)胞染色質(zhì)皺縮,出現(xiàn)凋亡小體,而且凋亡小體比例與AT1-AA存在明顯的劑量依賴。纈沙坦預(yù)處理細(xì)胞后,相比AT1-AA單獨處理細(xì)胞,EPCs細(xì)胞凋亡比例明顯得到逆轉(zhuǎn)。進(jìn)一步用細(xì)胞流式(Annexin V-FITC/PI雙染)檢測EPCs細(xì)胞凋亡情況,結(jié)果顯示,單獨AT1-AA(10μM,12h)處理細(xì)胞,EPCs細(xì)胞凋亡比例達(dá)到30.3%,纈沙坦預(yù)處理細(xì)胞后凋亡比例明顯得到逆轉(zhuǎn),降至13.7%。以上結(jié)果表明,AT1-AA可誘導(dǎo)EPCs凋亡致其生存活力降低,而纈沙坦可抑制此效應(yīng)。1.3 AT1-AA誘導(dǎo)EPCs內(nèi)ROS生成,增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度,促進(jìn)凋亡,纈沙坦可抑制此作用。研究表明ROS和Ca2+參與細(xì)胞凋亡轉(zhuǎn)導(dǎo)信號通路,而且在此信號通路中相互關(guān)系密切。為了驗證纈沙坦抑制AT1-AA誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞凋亡是通過降低EPCs內(nèi)ROS水平及Ca2+濃度,以纈沙坦(1μM)預(yù)處理EPCs 4h,然后AT1-AA(10μM)處理細(xì)胞12h,或者AT1-AA(10μM)單獨處理細(xì)胞6、12和24h。結(jié)果表明,AT1-AA上調(diào)了內(nèi)皮祖細(xì)胞內(nèi)ROS水平,早在90分鐘的時候,細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度就有了明顯提高,而且AT1-AA對內(nèi)皮祖細(xì)胞的影響存在濃度依賴。與此同時,纈沙坦預(yù)處理內(nèi)皮祖細(xì)胞后,相對AT1-AA單獨處理細(xì)胞,EPCs內(nèi)ROS水平及鈣離子濃度均得到了明顯的逆轉(zhuǎn)。AT1-AA處理EPCs后,我們又對細(xì)胞鈣蛋白酶活性進(jìn)行了測定,結(jié)果鈣蛋白酶活性明顯增強(qiáng)。纈沙坦預(yù)處理細(xì)胞后,AT1-AA誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣蛋白酶活性的增強(qiáng)也同樣得到了逆轉(zhuǎn)。以上結(jié)果表明,AT1-AA通過升高EPCs內(nèi)ROS的表達(dá)及鈣離子濃度誘導(dǎo)EPCs凋亡,纈沙坦預(yù)處理可降低AT1-AA對EPCs的影響。1.4 AT1-AA誘導(dǎo)EPCs凋亡通過ROS依賴的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑,纈沙坦可抑制此效應(yīng)。文獻(xiàn)報道由藥物誘導(dǎo)的ROS水平和細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度上調(diào)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的激活共同引起了細(xì)胞的凋亡。本部分我們通過檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白(p-ERK、p-e IF-2α、CHOP、Bcl-2和Caspase-3)的表達(dá)來研究AT1-AA誘導(dǎo)的EPCs凋亡是否通過抑制ROS依賴的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑。以AT1-AA(10μM)單獨處理EPCs 0.5、1、3、6、9和12h,或者纈沙坦(1μM)預(yù)處理EPCs 4h后AT1-AA(10μM)處理12h,結(jié)果表明,AT1-AA單獨處理EPCs,AT1-AA時間依賴性激活了p-ERK1/2,而且處理6h時,p-ERK1/2的表達(dá)就有了明顯的升高,p-ERK、p-e IF-2α、CHOP和Caspase-3蛋白水平的表達(dá)也明顯升高,Bcl-2的表達(dá)明顯降低。纈沙坦預(yù)處理細(xì)胞后,與AT1-AA單獨處理細(xì)胞相比,AT1-AA誘導(dǎo)的p-ERK、p-e IF-2α、CHOP和Caspase-3的升高及Bcl-2的降低均得到了逆轉(zhuǎn)。以上結(jié)果表明,AT1-AA誘導(dǎo)的EPCs凋亡是通過ROS依賴的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑,纈沙坦可抑制此效應(yīng)。結(jié)論:1.AT1-AA可誘導(dǎo)ERK的激活從而調(diào)節(jié)p-e IF2α,CHOP,Bcl-2和Caspase-3,升高EPCs內(nèi)ROS的表達(dá)及Ca2+濃度,即通過促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激依賴的凋亡途徑誘導(dǎo)EPCs凋亡。2.纈沙坦可通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激依賴的凋亡途徑拮抗AT1-AA誘導(dǎo)的EPCs凋亡。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R541.4

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本文編號：1530995