本文關(guān)鍵詞： 束縛應(yīng)激 對乙酰氨基酚 肝損傷 谷胱甘肽 兒茶酚胺 α受體　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景和目的 對乙酰氨基酚(商品名為撲熱息痛,Acetaminophen,簡稱APAP)是世界上應(yīng)用最廣泛的非處方類解熱鎮(zhèn)痛藥。在美國銷售的含有APAP的制劑超過300種,平均每年的銷量是十億片。盡管在常規(guī)治療劑量下APAP非常安全,但是該藥的治療窗較窄。因為過量使用APAP每年有大于100,000例的患者需要到中毒治療中心接受治療,其中包括超過56,000的門診患者和2600例的住院病人和估計458例死于急性肝衰竭的病人。根據(jù)美國急性肝衰竭研究委員會報告,美國50%的急性肝衰竭病人都是由于APAP中毒,每年的人數(shù)超過1100人。有人報道,在APAP導(dǎo)致急性肝衰竭的發(fā)生率每年呈遞增趨勢,1998年是21%,而2003年是51%。由于對乙酰氨基酚的肝毒性,在2011年1月美國FDA發(fā)布公告要求在處方藥中APAP的含量每片不得超過325mg。在2014年2月FDA又發(fā)布報告,建議醫(yī)生和醫(yī)療人員禁用含APAP超過325mg的藥品。雖然過量使用是導(dǎo)致APAP肝臟毒性的重要原因,但也有很多導(dǎo)致APAP中毒的風險因素,包括營養(yǎng)不良、飲酒和聯(lián)合用藥。迄今為止未見有研究報道外界應(yīng)激對APAP肝毒性的影響。 應(yīng)激是一種機體狀態(tài),指機體在內(nèi)部或外界刺激或應(yīng)激原的影響下后,機體產(chǎn)生的一系列非特異性應(yīng)答反應(yīng)。應(yīng)激原可以是物理因素,也可以是精神因素或二者的綜合作用。當機體受到強烈刺激時,機體就會興奮交感-腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)(sympathoadrenomedullary system,SAM)和下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸(hypothalamic-pituitary-adrenal,HPA),表現(xiàn)為釋放兒茶酚胺和糖皮質(zhì)激素等外周遞質(zhì)。很早之前,大家已經(jīng)認識到應(yīng)激能夠影響許多疾病的發(fā)生發(fā)展過程和結(jié)果。目前人們主要關(guān)注的是應(yīng)激與心血管系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、消化系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病、HIV/AIDS以及癌癥等之間的關(guān)系。大量的研究結(jié)果表明應(yīng)激可以抑制特異性免疫反應(yīng),誘導(dǎo)產(chǎn)生或加重抑郁癥、心血管系統(tǒng)疾病、肝臟疾病,并促進HIV/AIDS和癌癥的病情發(fā)展。 目前,有越來越多的證據(jù)表明應(yīng)激對肝臟疾病和功能存在影響。根據(jù)早期的臨床報道,社會心理應(yīng)激可以影響肝臟疾病的發(fā)生、發(fā)展及結(jié)果。例如,Hirose等發(fā)現(xiàn)情緒應(yīng)激反應(yīng)(如受到催眠暗示的恐懼或焦慮)可以明顯增加肝臟血流量(HBF)。Fukudo等研究發(fā)現(xiàn),酒精性肝炎中社會心理應(yīng)激的嚴重程度與肝炎惡化及肝臟纖維化變化之間存在緊密的聯(lián)系。在Beck Depression Inventory雜志中,也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在慢性乙型病毒性肝炎患者,其血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine transaminase,ALT)水平與其精神抑郁程度之間存在明顯的正相關(guān)關(guān)系。而且,即使剔除了包括年齡、性別、教育水平、抽煙、飲酒與否以及病程等混雜因素,在Grossarth-Maticek分型中慢性丙型病毒性肝炎的嚴重性與I型人格人群具有相關(guān)性。在原位肝臟移植中,發(fā)生急性排斥反應(yīng)的患者手術(shù)前的人格品質(zhì)更傾向于是那些“順從的”“相對易于受人控制的”以及“淡漠心境”者。在動物試驗研究中,人們同樣證明了應(yīng)激與肝臟疾病之間的緊密相互聯(lián)系。例如,電擊應(yīng)激可以加重四氯化碳處理過的小鼠肝臟損害,也可以使α-半乳糖胺誘導(dǎo)的肝炎加重,這種肝炎和瘧疾、沙門氏菌感染誘導(dǎo)的肝損害以及乙型、丙型病毒性肝炎有關(guān)。有人在給大鼠施加多種不同的急性應(yīng)激后,電鏡檢查發(fā)現(xiàn)肝臟粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)破裂并膨脹,糖原耗竭,線粒體腫脹,其中最顯著的變化是細胞膜的自噬泡數(shù)量增多和體積變大。有意思的是,即使在正常的嚙齒類動物中,束縛以及電擊應(yīng)激可以觸發(fā)溫和的肝臟損害,這種肝損害以輕度的血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)水平升高為特點。此外,社會隔絕應(yīng)激(social isolation stress)可以增加轉(zhuǎn)化生長因子-α轉(zhuǎn)基因小鼠自發(fā)性肝細胞肝癌的發(fā)生率,同時還可以加速小鼠結(jié)腸腫瘤肝轉(zhuǎn)移進程。 動物束縛應(yīng)激模型是一種直接、非損傷性和簡單的心理與生理應(yīng)激模型。束縛應(yīng)激可產(chǎn)生心理性的逃避反應(yīng)和限制機體行動。束縛應(yīng)激模型不但可準確且可靠地控制應(yīng)激實驗條件,而且與給藥造模、手術(shù)造模以及外界強烈的溫度改變或噪音相比,束縛應(yīng)激模型可以有效地檢測促腎上腺皮質(zhì)素、皮質(zhì)酮、fos蛋白、HPA軸的脫敏和細胞因子的表達。同時束縛應(yīng)激可以協(xié)同多種因素進行研究,例如學(xué)習記憶、攝食情況和聲音刺激等。在最近15年間,束縛應(yīng)激模型一直是使用最多的應(yīng)激動物模型。 本課題研究目的是：一、考察束縛應(yīng)激對APAP給藥后肝毒性的影響及可能的發(fā)生機制；二、探討兒茶酚胺遞質(zhì)和腎上腺受體在束縛應(yīng)激誘導(dǎo)肝損傷過程中作用。 方法 實驗選用Balb/c小鼠,雄性,SPF級,8-10周齡,購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心。動物飼養(yǎng)于解放軍疾病預(yù)防控制所毒理學(xué)評價研究中心屏障設(shè)施內(nèi),溫度控制在19-26℃,12小時照明,12小時黑暗,動物自由進食飲水。正式實驗前動物檢疫觀察3天。實驗前一天禁食過夜,實驗當天同一時間(上午8：00)將動物放入束縛筒內(nèi),束縛后保證小鼠自由呼吸,身體無法扭動同時不受擠壓。束縛應(yīng)激后動物或者被立刻麻醉處死或者放回籠內(nèi)繼續(xù)飼養(yǎng)。動物處死時,均用戊巴比妥鈉麻醉,從腹主動脈采血。動物采血后,立刻取下肝臟,生理鹽水沖洗,取左肝頁用中性福爾馬林固定,石蠟包埋用于病理組織學(xué)檢查。剩余的肝臟用液氮速凍并保存于-80℃。 在考察束縛應(yīng)激對對乙酰氨基酚肝毒性影響的實驗中,在束縛應(yīng)激后的各時間點腹腔注射150mg/kg的APAP或生理鹽水。APAP給藥后4小時,動物麻醉處死采樣。在考察兒茶酚胺遞質(zhì)和腎上腺素受體對束縛應(yīng)激誘導(dǎo)肝損傷影響的實驗中,束縛前30分鐘腹腔注射1mg/kg的哌唑嗪用于阻斷α-1受體；束縛前30分鐘腹腔注射2mg/kg的育亨賓用于阻斷a-2受體；束縛前30分鐘腹腔注射20mg/kg的倍他洛爾用于阻斷β-1受體；束縛前30分鐘腹腔注射5mg/kg的ICI118,551用于阻斷β-2受體；束縛前24小時皮下注射2mg/kg的利血平用于耗竭兒茶酚胺遞質(zhì)。 用全自動生化分析儀檢測血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST),用用酶循環(huán)法測定肝臟中谷胱甘肽的含量；用酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測血清IL-6和TNF-a含量。對肝組織進行病理學(xué)檢測,HE常規(guī)染色觀察病變程度。用TUNEL法原位檢測細胞凋亡情況。用免疫組化法檢測檢鋇Kupffer細胞活性情況。用蛋白免疫印跡(Western Blot)法檢測肝組織caspse-3、Caspase-9、Bcl-2,和Bax的蛋白表達量。 統(tǒng)計學(xué)處理 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析處理,用均數(shù)士標準差(Meand士SD)表示；單因素試驗的多組比較采用單因素方差分析(One. way ANOVA),方差齊時采用多重比較LSD法,方差不齊時采用Dunnett' ST3法。在考察束縛和藥物相互干預(yù)的試驗中采用雙因素方差分析比較各處理方式的主效應(yīng)及交互效應(yīng)。當P0.05時,差異被認為有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果 第一部分：小鼠束縛應(yīng)激模型的建立 1.動物在束縛應(yīng)激0、0.5、1.5、3、6小時后,組間血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=5.114,24.666；P均小于0.01),表現(xiàn)為ALT和AST在束縛前3小時持續(xù)性的升高。與正常對照組(束縛0小時)相比,束縛應(yīng)激1.5和3小時后ALT和AST的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05或P0.01)。其中在束縛應(yīng)激3小時后,ALT的水平達到正常值的3倍,根據(jù)海氏法則可認為小鼠束縛應(yīng)激3小時肝細胞達到了損傷的標準。但是,當束縛應(yīng)激6小時后,血清ALT和AST的水平開始降低,此時AST與正常對照組相比差異仍有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 2.當小鼠束縛1.5、3小時及束縛3小時放松6小時后,各組間血清ALT和AST水平的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=16.000,27.268；P均小于0.01)。當小鼠束縛應(yīng)激3小時后,血清ALT和AST的水平達到最高值,然后將動物放回籠中自由活動,放松后血清ALT和AST水平開始恢復(fù),放松6小時時,血清ALT和AST水平與正常對照組相比差異仍有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；在放松24小時后,ALT值基本達到正常值水平。但是AST與正常對照組相比差異仍有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。 3.束縛不同時間后肝臟總谷胱甘肽(GSH+GSSG)含量、氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量和GSSG/GSH比值的組間差異有有統(tǒng)計學(xué)意義(F=7.199,13.522,22.817;P均小于0.01)。與血清ALT和AST水平的變化情況相同,束縛應(yīng)激3小時后(GSH+GSSG)含量降低、GSSG含量和GSSG/GSH比值和GSSG/GSH比值逐步升高,與正常對照組相比,這些指標的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01),其中束縛1.5小時后氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量和GSSG/GSH比值與正常對照組相比亦顯著性升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05或P0.01)。束縛3小時后將動物放回籠中自由活動,放松后總谷胱甘肽(GSH+GSSG)、GSSG和GSSG/GSH開始恢復(fù),至放松24小時后肝臟中的谷胱甘肽含量恢復(fù)至正常值水平。 4.正常對照組和束縛應(yīng)激0.5、1.5小時的動物肝臟病理組織學(xué)檢查未見異常,小鼠束縛應(yīng)激3小時后僅可見有輕度的肝細胞胞漿疏松淡染,未發(fā)現(xiàn)明顯的病理學(xué)改變。 第二部分：束縛應(yīng)激對對乙酰氨基酚肝毒性的影響 1.在小鼠束縛應(yīng)激0.5、1.5、3小時以及束縛3小時放松6、24小時后分別給予150mg/kg的APAP,結(jié)果發(fā)現(xiàn),組間ALT和AST的差異有統(tǒng)計學(xué)意義。(F=14.555,12.584；P值均小于0.01)。小鼠束縛3小時可使APAP引起的ALT和AST升高增強,束縛小3時放6小時后亦可使APAP引起的ALT升高增強,與單純APAP給藥組相比,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01),其中束縛3小時后立刻給予APAP,血清ALT和AST的升高幅度最大,達到單純給藥水平的4倍。但是束縛應(yīng)激0.5、1.5小時以及束縛3小時放松24小時后給藥,對APAP引起的ALT和AST變化影響不明顯,提示束縛應(yīng)激加重APAP肝毒性與束縛時間有關(guān)。 2.顯微鏡下觀察HE染色后的小鼠肝組織病理切片可見,正常對照組小鼠肝小葉輪廓清楚完整,肝細胞索排列整齊,肝竇清晰可見；APAP組動物肝臟中央靜脈周圍散在肝細胞壞死,伴隨空泡變性；束縛3小時+APAP組動物肝臟病變更加嚴重,中央靜脈周圍片狀肝細胞壞死,肝細胞排列紊亂,伴隨空泡變性及肝竇擴張充血；束縛3小時組小鼠未發(fā)現(xiàn)明顯的病理學(xué)改變,僅可見有輕度的肝細胞胞漿疏松淡染。 3.束縛應(yīng)激對正常對照組和APAP組動物肝臟的總谷胱甘肽(GSH+GSSG)含量、氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量和GSSG/GSH比值均有顯著性影響(F=24.113,3.079,1.239,P0.000,P=0.098,P=0.282;F=48.763,8.412,0.088,P0.000, P=0.010,P=0.770;F=33.764,13.909,9.282, P0.000,P=0.002,P=0.008)。束縛應(yīng)激后正常對照組和APAP組總谷胱甘肽(GSH+GSSG)含量均顯著降低,氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量和GSSG/GSH比值均顯著升高,與非束縛應(yīng)激組相比,這些差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05或P0.01)。表明束縛應(yīng)激不但可破壞正常動物的氧化還原平衡狀態(tài),還可加重APAP引起的肝臟谷胱甘肽耗竭。另外,APAP給藥后束縛應(yīng)激組動物(GSH+GSSG)含量顯著降低,GSSG/GSH比值顯著升高,與單純束縛應(yīng)激組相比這些差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05或P0.01)。APAP單獨給藥后肝臟GSSG含量升高,與正常對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 4.束縛3小時十APAP組與APAP組相比,血清IL-6水平、TNF-a水平以及肝臟Kupffer細胞的數(shù)量均無顯著性差異。與空白對照組相比,束縛3小時+APAP組和APAP組動物肝臟Kupffer細胞數(shù)量增多。 5.束縛應(yīng)激對正常對照組的IL-6水平有顯著影響,對APAP組動物IL-6水平無明顯影響(F=14.902,14.553,0.094,P=0.001,P=0.001,P=0.762)。束縛3小時組和正常對照組相比,血清IL-6和TNF-a水平呈現(xiàn)不同的變化趨勢,束縛應(yīng)激后IL-6水平顯著升高(P0.01),但TNF-a水平無顯著變化,均在很低的水平。束縛3小時組和正常對照組動物肝臟Kupffer細胞數(shù)量也無明顯差別。 6.用Western blot方法檢測肝臟caspse-3蛋白表達量,正常對照組動物肝臟caspse-3蛋白表達量很低,幾乎檢測不到。束縛3小時組動物肝臟caspse-3蛋白表達量較正常對照組上升,但是束縛3小時-APAP組和APAP組動物肝臟caspse-3蛋白含量亦是很低或幾乎檢測不到。 第三部分：束縛應(yīng)激損傷肝臟的發(fā)生機制 1.受體阻斷劑或耗竭劑、束縛應(yīng)激對動物血清ALT和AST水平均有顯著影響(F=127.803,6.392,6.515;F=240.972,7.713,9.062;P值均小于0.01),且受體阻斷劑或耗竭劑與束縛應(yīng)激之間存在交互效應(yīng)。束縛應(yīng)激后正常對照組和各受體阻斷劑或耗竭劑組ALT和AST水平均顯著升高,與非束縛應(yīng)激組相比,這些差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05或P0.01)。組間進行兩兩比較顯示,當用利血平完全耗竭兒茶酚胺或阻斷α-1或阻斷a-2受體后,與單純束縛應(yīng)激組相比,這三組血清ALT和AST水平均明顯降低,其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05或P0.01)；當阻斷β-1或β-2受體后,與單純束縛應(yīng)激組相比,給藥組血清ALT和AST水平?jīng)]有顯著性差異。此外α-1受體阻斷劑哌唑嗪、α-2受體阻斷劑育亨賓、β-1受體阻斷劑倍他洛爾、β-2受體阻斷劑ICI118,551和兒茶酚胺遞質(zhì)耗竭劑利血平對正常對照組動物血清ALT和AST水平均無影響。 2.受體阻斷劑或耗竭劑、束縛應(yīng)激對動物肝臟中總谷胱甘肽(GSH+GSSG)、GSSG和GSSG/GSH比值均有顯著影響(F=75.340,4.130,2.211,P0.000,P=0.003,P=0.068；F=107.928,4.685,6.951,P值均小于0.01；F=95.870,9.456,10.282,P值均小于0.01),且受體阻斷劑或耗竭劑與束縛應(yīng)激之間存在交互效應(yīng)影響GSSG和GSSG/GSH比)。組間進行兩兩比較顯示,當用利血平完全耗竭兒茶酚胺或阻斷α-1或阻斷α-2受體后,與單純束縛應(yīng)激組相比,這三組肝臟總谷胱甘肽含量顯著升高,GSSG和GSSG/GSH比值顯著降低,其差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)；哌唑嗪組、育亨賓組、倍他洛爾組、ICI118組以及正常對照組在束縛應(yīng)激后肝臟總谷胱甘肽含量顯著減少,與相應(yīng)未束縛組相比,其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05或P0.01)；育亨賓組、倍他洛爾組、ICI118組以及正常對照組在束縛應(yīng)激后肝臟GSSG含量顯著升高,,與相應(yīng)未束縛組相比,其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05或P0.01)；倍他洛爾組、ICI118組以及正常對照組在束縛應(yīng)激后肝臟GSSG/GSH比值顯著升高,與相應(yīng)未束縛組相比,其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)；另外,與交感神經(jīng)阻斷劑對束縛應(yīng)激后血清轉(zhuǎn)氨酶的影響相同,給予各種阻斷劑后,對正常對照組動物肝臟中總谷胱甘肽(GSH+GSSG)、GSSG和GSSG/GSH比值的影響無影響。 3.正常對照組小鼠肝臟中幾乎觀察不到凋亡的肝細胞,束縛應(yīng)激3小時后,出現(xiàn)凋亡的肝細胞數(shù)增多,其凋亡指數(shù)顯著增加,與正常對照組相比,差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。當用哌唑嗪阻斷α-1受體或用育亨賓阻斷a-2受體后出現(xiàn)凋亡的肝細胞數(shù)減少,與正常對照組相比無顯著性差異,且這兩個給藥組的肝細胞凋亡數(shù)相近。 4.束縛應(yīng)激3小時,Caspase-3和Caspase-9活化蛋白表達明顯增多,Bax/Bcl-2比值亦明顯升高；當用哌唑嗪阻斷α-1受體或用育亨賓阻斷a-2受體后,束縛后Caspase-3活化蛋白表達與正常對照組接近,而Caspase-9活化蛋白表達和Bax/Bcl-2比值仍有所增加,但與單純束縛應(yīng)激組相比增加幅度降低。 結(jié)論 1.束縛應(yīng)激可明顯加重APAP的肝毒性,表現(xiàn)為ALT和AST的升高,肝細胞壞死明顯。其發(fā)生機制是束縛應(yīng)激破壞了肝臟的氧化還原平衡狀態(tài),降低了肝臟內(nèi)的谷胱甘肽儲備量,而不是通過炎癥反應(yīng)所介導(dǎo)。同時證明了束縛應(yīng)激加重APAP誘導(dǎo)肝細胞死亡的主要方式是壞死而不是凋亡。 2.束縛應(yīng)激可通過減少肝臟谷胱甘肽的儲備量而導(dǎo)致可逆性的肝損傷,并通過caspase-9和Bcl-2家族蛋白誘導(dǎo)肝細胞凋亡。 3.α-1和α-2受體參與了束縛應(yīng)激損傷肝臟的過程。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R965

【參考文獻】

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本文編號：1526807