本文關鍵詞： 小鼠原位肝移植 缺血再灌注損傷 缺血預處理 遠端缺血期處理　出處：《吉林大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：第一部分小鼠原位肝移植模型的建立和評價目的:建立成熟穩(wěn)定的非動脈化的小鼠原位肝移植模型,并對肝移植模型進行評價,為后續(xù)相關實驗奠定基礎,亦為欲建立小鼠原位肝移植模型的研究者提供經(jīng)驗支持和技術參考,以快速、平穩(wěn)、安全地渡過學習瓶頸期。方法:單人操作,采用雙袖套法和支架法行非動脈化的小鼠同種異體原位肝移植術,詳細記錄供受體手術時間、無肝期、肝上下腔靜脈吻合時間、存活時間等指標,并探查死亡原因。手術方法定型后選用80對B6小鼠進行模型評價,前6組(每組10例)分別于術后第1天、3天、5天、7天、1個月、2個月行組織病理學檢查和肝功檢測,第7組(共20例)進行遠期存活率監(jiān)測。結(jié)果:建立模型過程中共行小鼠原位肝移植手術1074例,其中前541例主要用于鍛煉操作技能和積累圍手術期管理經(jīng)驗,之后453例主要為熟練定型階段。學習曲線表現(xiàn)為隨著練習次數(shù)的增加,供受體手術時間、無肝期、肝上下腔靜脈吻合時間均呈遞減趨勢,手術成功率和存活時間亦相應得到改善,但整體變化非常平緩。建模初期小鼠死亡原因多為無肝期過長、供體灌注不良、肝上下腔靜脈和肝下下腔靜脈吻合口出血,后期死亡原因主要為膽道并發(fā)癥。模型評價階段,無肝期為17.4±2.3min,SHVC吻合時間為11.0±1.3min,手術成功率為96.3%(77/80),術后第1天、第3天、第5天、第7天、1個月、2個月和3個月的存活率分別為95%(19/20),95%(19/20),90%(18/20),85%(17/20),75%(15/20),60%(12/20)和35%(7/20)。ALT和AST在術后第三天達到峰值,肝臟病理學改變最為明顯。結(jié)論:在大量的練習和不斷的摸索、嘗試后成功建立了小鼠原位肝移植模型,熟練的顯微外科操作技術是首要條件,手術的難度在于操作的復雜性和手術步驟的嚴格時限,手術的關鍵在于麻醉、供肝的灌注和保存、套管技術和無肝期的精準把控。術后肝臟組織病理學和肝功變化規(guī)律為下一步研究缺血預處理和遠端缺血期處理對小鼠原位肝移植后缺血再灌注損傷的保護作用提供了實驗依據(jù)。第二部分缺血預處理和遠端缺血期處理對小鼠肝移植缺血再灌注損傷的保護作用及其機制目的:觀察遠端缺血期處理對小鼠肝移植缺血再灌注損傷是否具有保護作用,比較缺血預處理和遠端缺血期處理對小鼠肝移植缺血再灌注損傷保護作用的強度,并探究二者聯(lián)合應用是否能產(chǎn)生疊加的保護作用及可能存在的作用機制。方法:160只健康成年雄性B6小鼠隨機分成4組:假處理組(sham組,n=40):僅行小鼠原位肝移植術,無任何特殊處理;2缺血預處理組(IPC組,n=40):供體開腹后游離肝臟,用顯微血管夾夾閉小鼠肝動脈和門靜脈10分鐘,開放15分鐘后,進行供肝的獲取;3遠端缺血期處理組(RIPer組,n=40):受體麻醉后,在肝臟再灌注前用顯微血管夾對小鼠兩側(cè)股血管束反復進行5分鐘夾閉、5分鐘開放,共3個循環(huán);4聯(lián)合應用缺血預處理和遠端缺血期處理組(IPC+RIPer組,n=40):供體行缺血預處理,受體行遠端缺血期處理。各組小鼠分別于再灌注后2小時、24小時和72小時切取肝臟行組織病理學檢查、TUNEL染色、F4/80免疫組化染色、MDA水平檢測、GSH-Px水平檢測、ICAM-1 m RNA、Bcl-2 m RNA及Bax m RNA水平檢測、NF-κB p65蛋白表達水平檢測,并從下腔靜脈取血檢測血清ALT、AST、TNF-α、NOx水平,流式分析外周血白細胞表面抗原CD11b、CD16/32和F4/80的表達情況。結(jié)果:雖然各組間小鼠術后存活率無統(tǒng)計學差異,但是與sham組相比,三個處理組小鼠術后的ALT、AST、MDA、TNF-α、ICAM-1 m RNA、NF-κB p65蛋白水平、Suzuki評分、凋亡指數(shù)、肝臟組織中F4/80陽性細胞比例、CD11b+和F4/80+細胞在白細胞中的比例、CD11b+CD16/32+細胞和CD11b+CD16/32high細胞在CD11b+細胞中的比例上升幅度均較小,而GSH-Px、NOx以及Bcl-2 m RNA/Bax m RNA比值則有所提升(P0.05)。在移植術后早期(2h),IPC組和RIPer組在ALT、TNF-α、GSH-Px、NOx和肝臟組織F4/80陽性細胞比例等方面有統(tǒng)計學差異。除Suzuki評分、Bcl-2 m RNA/Bax m RNA比值、F4/80+細胞在白細胞中的比例外,其他指標均在不同的時間點顯示IPC組和RIPer組均與IPC+RIPer組有顯著性差異(P0.05)。結(jié)論:本實驗采用的遠端缺血期處理策略可以對小鼠原位肝移植缺血再灌注損傷發(fā)揮有效的保護作用。在移植術后早期(2h),遠端缺血期處理對小鼠原位肝移植IRI的保護作用弱于IPC,然而后期兩者的保護效力無明顯區(qū)別。提示遠端缺血期處理同缺血預處理一樣,亦有兩個保護時間窗,而在第一保護時間窗內(nèi)抑制庫弗細胞活化、調(diào)整微循環(huán)障礙及抗氧化作用較弱導致其保護效力較弱。聯(lián)合應用缺血預處理和遠端缺血期處理可以在抗氧化應激、抗凋亡、調(diào)整微循環(huán)障礙、抑制固有免疫反應方面產(chǎn)生疊加作用,從而進一步加強對小鼠原位肝移植缺血再灌注損傷的保護作用。
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【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R657.3

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