發(fā)布時間：2018-02-14 23:27

  本文關鍵詞： 胰腺癌 雷公藤甲素 核仁素適配子 選擇性 流式細胞術　出處：《湖北大學》2014年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：背景：進展性胰腺癌(advanced pancreatic cancer, PC)是一類高轉移、易復發(fā)、有著極差預后的常見消化道惡性腫瘤。目前臨床上并沒有明顯效果的化療藥物,多藥耐藥性及癌細胞轉移是造成胰腺癌化療失敗的主要原因。雷公藤甲素(triptolide, TP)能在體外通過多種機制顯著抑制多藥耐藥胰腺癌細胞株的生長,顯示出了優(yōu)于吉西他濱的抗腫瘤效果。但雷公藤甲素的非特異性組織分布造成了嚴重的肝毒性,限制了其向臨床轉化。核酸適配子(aptamer)是一種能特異性結合到靶細胞表面的單鏈寡聚核苷酸核,核仁素特異性適配子AS1411具有核仁素(胰腺癌細胞表面高表達)靶向性及較好的安全性；我們以AS1411為“靶頭”,以胰腺癌細胞表面高表達的核仁素為藥物傳遞靶點,促使雷公藤甲素特異性靶向并內化入胰腺癌細胞。本研究在體外細胞水平及胰腺癌小鼠模型體內考察了雷公藤甲素-核仁素適配子耦合物的靶向性及抗腫瘤活性,從而為其向臨床轉化提供了有力證據。 目的：本研究作為智能雷公藤甲素-核酸耦合物靶向抗胰腺癌新藥開發(fā)的一部分,目的是在體內外考察雷公藤甲素-核仁素適配子耦合物的靶向性及抗腫瘤活性,并對其進入細胞途徑和抗腫瘤機制作初步探究,為進一步體內的藥理,毒理研究及向臨床轉化提供參考依據。 方法： 1.體外選擇性考察： 人胰腺癌細胞系(MIA PaCa-2),人正常胰腺細胞株(HPC-Y5),人正常肝細胞株(L-02)分別與Cy3熒光標記的TP-AS1411耦合物,TP-CRO耦合物在37℃下共孵育一段時間,離心去除未與細胞結合的配體后,熒光顯微鏡觀察細胞內部的熒光分布情況,流式細胞儀檢測不同藥物處理的各個細胞系的平均熒光強度。 2.體內選擇性分布考察： 雌性裸小鼠10只,建立Mia PaCa-2荷瘤小鼠模型。成瘤后,所有老鼠被隨機分為2組(每組5只)：a.Cy3標記的TP-AS1411生理鹽水溶液,b.Cy3標記的TP-CRO生理鹽水溶液。分別于4,12,24,48小時用熒光成像系統(tǒng)(Xenogen IVIS imaging system)進行活體熒光檢測,并于24小時后處死,收集心、肝、脾、肺、腎、腫瘤等組織并檢測各自熒光強度。 3.體外抗腫瘤活性考察： MTT實驗檢測不同濃度的TP-AS1411耦合物對人胰腺癌細胞系(MIA PaCa-2)分別在24小時和48小時的殺傷作用,以TP和吉西他濱為陽性對照。免疫印跡法(Western Blot)檢測不同濃度藥物處理的細胞中及血管內皮新生因子(VEGF)表達水平的變化情況。 4.胰腺癌小鼠模型治療效果評價： 雌性裸小鼠建立Mia PaCa-2荷瘤小鼠模型,成瘤后,隨機分成5組(每組10只)：a.空白生理鹽水溶液(空白對照組),b.雷甲素乙醇／水溶液,c.吉西他濱藥物組,d. TP-AS1411耦合物藥物低劑量組,e:TP-AS1411耦合物高劑量組。進行治療試驗,以小鼠生存周期、體重、腫瘤生長抑制率為考察指標。每周給藥一次,連續(xù)給藥8周后,結束治療。麻醉取血后直接處死,血清樣本用ELISA檢測VEGF表達水平,將實體瘤剝離,稱瘤重,并拍照。 結果： 1. TP-AS1411耦合物與Mia PaCa-2細胞結合的熒光強度明顯高于其它與其它細胞結合的熒光強度。而對照組藥物與三種細胞結合的熒光強度幾乎沒有區(qū)別。 2.對于TP-AS1411耦合物組,腫瘤部位的Cy3熒光信號在整個實驗過程中一直都很明顯,而在其它正常組織中的熒光信號相對較弱,且在24h后幾乎完全消除。對于TP-CRO對照組,Cy3熒光信號的分布沒有表現(xiàn)出明顯的特異性,且48h時在肝、腎臟等組織中依然能檢測到較強的熒光信號。 3.隨著三種藥物濃度的增加及藥物作用時間的延長,Mia PaCa-2細胞的存活率都有不同程度的降低,而且表現(xiàn)出了時間劑量依賴性,相同濃度下TP-AS1411對Mia PaCa-2的生長抑制率總要高于吉西他濱對它的(25nM-200nM)。在50nM,100nM及200nM的濃度梯度內,TP-AS1411耦合物都能有效的抑制Mia PaCa-2細胞系中VEGF的表達。 4.用藥第4,8周后,TP-AS1411耦合物高劑量組抑瘤率分別為56.33%和74.29%,TP-AS1411耦合物低劑量組抑瘤率為48.27%和67.24%,吉西他濱對照組抑瘤率分別為40.29%和44.35%。ELISA結果顯示,經過TP-AS1411耦合物干預后,荷瘤鼠外周血中VEGF含量得到顯著水平的降低,接近正常水平。 結論： 1.TP-AS1411耦合物在體外能選特異性地靶向Mia PaCa-2細胞,而規(guī)避其它正常細胞。 2.TP-AS1411耦合物在荷瘤鼠體內能選擇性的在腫瘤組織內大量積聚,而相對減少在其它正常組織內的分布。 3.無論是在體內外,AS1411對TP的修飾未影響其抗腫瘤活性及抗腫瘤血管新生活性。
[Abstract]:Background: advanced pancreatic cancer (advanced pancreatic, cancer, PC) is a kind of high metastasis, recurrence, have a poor prognosis of common malignant tumor of digestive tract. Chemotherapy drugs currently in clinical and there is no obvious effect, multidrug resistance and metastasis of cancer cells is the main cause of pancreatic cancer treatment failure. Triptolide (triptolide, TP) through a variety of mechanisms can significantly inhibit the multidrug resistance of pancreatic cancer cell lines in vitro showed superior to gemcitabine antitumor effect of triptolide. But nonspecific tissue distribution caused severe hepatotoxicity, restricts its clinical transformation. Aptamer (aptamer) is a a specific binding to single stranded oligo nucleotide poly nuclear target cell surface nucleolin, specificity of aptamer AS1411 with nucleolin (high surface expression of pancreatic cancer cells) targeting and good safety; we As the "target" with AS1411, with a high surface expression of pancreatic cancer cell transfer targets for drugs in the nucleolus, prompting prime specific target of triptolide in pancreatic cancer cells and to internalize into. In this study, in vitro and in a mouse model of pancreatic cancer effects of triptolide - nucleolin aptamer coupled complex target orientation and antitumor activity, thus provides the powerful evidence to clinical transformation.
Objective: the purpose of this study as intelligent triptolide - nucleic acid conjugates targeting part of anti pancreatic cancer drug development, the purpose is to investigate the effects of triptolide - nucleolin aptamer conjugates targeting antitumor activity to and in vivo, and the way to enter the cell and anti tumor mechanism for a preliminary inquiry, further in vivo pharmacological, toxicological study and clinical transformation to provide reference.
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本文編號：1511875