本文關鍵詞： 三味干姜散 酒精性肝損傷 免疫性肝損傷 肝臟線粒體 血清藥物化學　出處：《廣州中醫(yī)藥大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的:本課題從保護肝臟線粒體結構和功能的角度出發(fā),復制酒精性肝損傷模型和ConA免疫性肝損傷模型,探討三味干姜散的保肝機制,并研究其入血成分,為三味干姜散的臨床應用奠定物質基礎。方法:1.將72只SD大鼠隨機分為正常組、酒精模型組、水飛薊素陽性組、三味干姜散高、中、低劑量干預組。除正常組以外,各組上午灌胃55%酒精,下午灌胃相應藥物,連續(xù)10d,正常組灌胃相應劑量的蒸餾水,制備酒精性肝損傷大鼠模型,在末次給藥12h以后,2%戊巴比妥鈉麻醉,腹主動脈取血,分離的血清用于檢測肝功指標ALT、AST,肝臟用于HE切片染色進行病理觀察,提取的肝臟線粒體用于檢測線粒體膜電位、膜通透性、SOD、8-OHdG、呼吸鏈酶復合物Ⅰ、Ⅲ;制備肝勻漿檢測MDA、GSH、GSH-Px,RT-PCR 檢測肝細胞中 Nrf2、Bach1 和 HO-1 mRNA 的表達;Western Blot檢測肝組織中Nrf2、Bach1以及HO-1蛋白的表達水平。2.將72只KM小鼠隨機分為正常組、ConA模型組、水飛薊素陽性組、三味干姜散高、中、低劑量干預組。除正常組以外,各組每天灌胃相應體積藥物1次,連續(xù)7d,正常組灌胃等體積的蒸餾水,在末次給藥以后12h,除正常組外,其余各組尾靜脈注射ConA 25mg/kg,制備ConA免疫性肝損傷模型。造模4h后眼球取血,分離出的血清用于檢測肝功指標ALT、AST,分離的肝臟用于HE切片染色進行病理學觀察,提取的肝臟線粒體檢測線粒體膜電位、SOD、8-OHdG,制備肝勻漿測定MDA、GSH、GSH-Px。3.通過超高效液相-質譜聯(lián)用儀測定,并建立三味干姜散化學成分信息庫,利用Peakview軟件對三味干姜散含藥血清、空白血清、單復方化合物成分進行篩查,以6-姜酚對照品,以期尋找三味干姜散入血成分。結果:1.用55%酒精給SD大鼠灌胃造模10天后,發(fā)現(xiàn)酒精模型組血清中的ALT、AST水平升高(P0.01);HE切片染色病理觀察結果表明,酒精模型組肝小葉之間的界限不是很清晰,肝細胞索發(fā)生紊亂,肝竇范圍變窄,肝細胞也濁腫,而胞質出現(xiàn)疏松,淡染,更有大部分的肝細胞出現(xiàn)腫脹,呈現(xiàn)出氣球樣的病變。酒精模型組的熒光強度比值下降,表明JC-1單體增多,膜電位△Ψm下降(P0.05),在1Omin以內A540值迅速下降,△A540值上升明顯(P0.05),表明線粒體容積增大,光散射性下降。SOD酶活性顯著下降(P0.01),GSH-Px酶活性顯著下降(P0.01),GSH活性下降(P0.05);MDA活性顯著增加(P0.01),8-OHdG含量顯著增加(P0.01);2.呼吸鏈復合物Ⅰ和Ⅲ酶活性顯著性降低(P0.01);肝組織中的Nrf2、Bach1、HO-1mRNA的表達水平提高,其中Nrf2、HO-1mRNA表達水平(P0.05),Bach1 mRNA表達水平(P0.01)。三味干姜散干預組肝細胞水腫癥狀均有不同程度緩解,三味干姜散高劑量能降低血清中ALT水平(P0.05),能升高SOD酶活性(P0.05),升高GSH-Px酶活性(P0.05),能增加GSH酶活性(P0.01),10min內△A540下降(P0.05),能降低8-OHdG含量(P0.01),降低MDA活性(P0.01),能顯著增加呼吸鏈復合物Ⅲ酶活性(P0.01),增加呼吸鏈復合物Ⅰ(P0.05),能上調Nrf2和HO-1mRNA的表達(P0.05);中劑量能降低血清中ALT、AST水平(P0.05);能增加GSH酶活性(P0.01),能顯著降低8-OHdG含量(P0.01)、降低MDA活性(P0.05),能顯著增加呼吸鏈復合物Ⅰ、Ⅲ酶活性(P0.01);低劑量組能降低MDA活性和8-OHdG含量(P0.05),增加呼吸鏈復合物Ⅲ酶活性(P0.05)。2.尾靜脈注射ConA造模后,發(fā)現(xiàn)模型組小鼠血清中ALT、AST水平顯著上升(P0.01);HE切片染色病理學觀察發(fā)現(xiàn),模型組的肝細胞發(fā)生水腫,有的充血壞死,肝小葉結構也受到破壞,嚴重的還出現(xiàn)小灶樣壞死以及炎癥細胞浸潤,匯管區(qū)被大量炎性細胞所浸潤。模型組的熒光強度比值下降,表明JC-1單體可能增多,膜電位△Ψm明顯下降(P0.05),并且在10min以內A540值迅速下降,△A540值明顯上升(P0.05),表明線粒體容積可能增大,光散射性下降;SOD酶、GSH-Px酶活性顯著下降(P0.01),GSH活性下降(P0.01);MDA活性顯著增加(P0.05),而8-OHdG含量卻顯著增加(P0.01);在病理觀察中,三味干姜散干預組對于模型組出現(xiàn)的肝細胞狀況都有著不同程度緩解,其中高劑量組能顯著降低血清中的ALT、AST的含量水平(P0.01),能升高SOD酶活性(P0.05),升高GSH-Px、GSH酶活性(P0.01),能降低8-OHdG含量(P0.01),降低MDA活性(P0.01);中劑量組的熒光強度比值增加,表明JC-1聚合物可能增多,膜電位△Ψm明顯上升(P0.01),還能增加GSH-Px酶活性(P0.05),能降低8-OHdG含量(P0.01);低劑量能升高GSH酶活性(P0.05)。3.以6-姜酚作為對照品,對空白血清、三味干姜散含藥血清、復方以及單方進行檢測,發(fā)現(xiàn)6-姜酚在含藥血清、三味干姜散復方以及干姜單方中的保留時間基本一致,其在二級質譜圖中的特征碎片峰基本一致,提示6-姜酚可能是以原型入血。結論:1.三味干姜散的保肝作用與其對肝臟線粒體的保護有關,具體表現(xiàn)為保護線粒體的膜結構、提高抗氧化酶的數(shù)量,減輕DNA的氧化損傷以及恢復線粒體的氧化還原系統(tǒng),調控內源性抗氧化系統(tǒng),減輕機體脂質抗氧化反應,上調Nrf2、Bach1以及HO-1基因和蛋白的表達。2.經過UPLC-MS法檢測得出6-姜酚可能是三味干姜散的入血成分,并以原型入血。
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【學位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5
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本文編號：1481370