本文關(guān)鍵詞： 全氟異丁烯 急性肺損傷 自噬 微管相關(guān)蛋白輕鏈3 雷帕霉素 3-甲基腺嘌呤　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：全氟異丁烯(Perfluoroisobutylene,PFIB)是一種有機氟工業(yè)生產(chǎn)中的氣態(tài)副產(chǎn)物,劇毒,它能夠穿透普通防毒面具的防護而損傷人體。其毒性是光氣的10倍,即使少量吸入就可引起急性肺損傷(Acute Lung Injury,ALI)的發(fā)生,嚴重者可以發(fā)展成急性呼吸窘迫綜合征致其死亡。PFIB引起的吸入性肺損傷,起病急驟,主要的臨床特征為漸進性呼吸困難及難治性低氧血癥。由于目前對PFIB所致ALI的致病機理尚不完全清楚,致使缺乏行之有效的治療手段及醫(yī)學(xué)防護措施。國內(nèi)外實驗室及本課題組的先期研究發(fā)現(xiàn):PFIB引起的ALI主要是中性粒細胞(Polymorphonuclear neutrophil,PMN)活化所致的過度炎癥反應(yīng)的結(jié)果。但是臨床上單純使用激素沖擊性抗炎治療,效果并不顯著,死亡率仍然較高。自噬(autophagy)是真核細胞獨有的一種利用溶酶體降解細胞內(nèi)物質(zhì)的過程。它具有兩方面的作用:一方面可以降解細胞質(zhì)中破碎的細胞器及過多或者變性的大分子物質(zhì),為細胞及蛋白質(zhì)的合成提供能量及養(yǎng)料;另一方面它的過度活躍或者低下則有可能對細胞造成不利影響甚至破壞。近年來研究發(fā)現(xiàn)自噬過程與多種肺部疾病如急性肺損傷、肺動脈高壓、肺部感染、慢性阻塞性肺疾病、特發(fā)性肺纖維化等的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。自噬的“雙刃劍”作用,使它在不同細胞乃至不同類型肺損傷中的作用也不完全相同。本實驗的目的是了解PFIB吸入性肺損傷中肺組織是否有自噬活動的變化,揭示自噬的活動規(guī)律,探究自噬在PFIB所致ALI中的作用,為PFIB吸入性肺損傷的醫(yī)學(xué)防治和尋找治療靶標提供參考。首先將42只SPF級Wistar雄性大鼠(8周齡,180-200 g)隨機分為7組(n=6)。根據(jù)本課題組先期研究的PFIB所致的吸入性肺損傷動物模型制備方法,對6個染毒組大鼠進行全身暴露動態(tài)吸入PFIB染毒(PFIB濃度290 mg/m3,染毒時間8 min),正常對照組在過濾空氣下暴露8 min。分別于暴露后的1 h、2 h、4 h、8h、16 h及24 h 6個時間點對42只大鼠麻醉處死,并收集大鼠肺組織和支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)等樣本。通過測定大鼠肺系數(shù)(肺濕干比、肺含水量、肺濕體比、肺干體比)、BALF中總蛋白含量,并進行肺組織病理學(xué)檢查。然后通過透射電鏡觀察肺組織中自噬體的變化情況,蛋白免疫印跡法(Western blot)測定微管相關(guān)蛋白輕鏈3(LC3)的表達變化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn):大鼠在PFIB染毒后16 h及24 h的肺系數(shù)和BALF中總蛋白含量顯著升高,發(fā)生急性肺間質(zhì)與肺泡水腫伴大量PMN滲出。對比本課題組以往的實驗結(jié)果,證實本次實驗的大鼠PFIB所致的ALI模型復(fù)制成功。在正常對照組以及PFIB染毒后1 h、2 h、4 h、8 h5個組中的Ⅰ型及Ⅱ型肺泡上皮細胞中均可見自噬體,且以染毒后1 h易見。PFIB染毒后1 h LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值顯著升高,之后持續(xù)下降,24 h降至基礎(chǔ)水平。以上實驗結(jié)果提示,PFIB所致的ALI中伴有自噬活動的變化,存在消長現(xiàn)象�；谝陨辖Y(jié)果,我們進一步采用常用的自噬工具藥——自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素(rapamycin,RAPA)和自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)——來干預(yù)大鼠細胞自噬水平,觀察對大鼠PFIB所致的ALI的影響。進一步探究自噬在PFIB所致的ALI中的作用。在3-MA抑制自噬的實驗中,48只SPF級雄性大鼠(8周齡,180-200 g)隨機分為8組(n=6),分別為溶劑對照1 h組、給藥對照1 h組、溶劑染毒1 h組、給藥染毒1 h組、溶劑對照8 h組、給藥對照8 h組、溶劑染毒8 h組和給藥染毒8 h組。其中4個給藥組動物在染毒或空氣暴露前30 min腹腔注射3-MA一次,劑量為30 mg/kg bw。4個溶劑組動物參照相應(yīng)的給藥方式及體積給予生理鹽水。對4個染毒組大鼠進行全身暴露動態(tài)吸入PFIB染毒(PFIB濃度290 mg/m3,染毒時間8 min),4個對照組在過濾空氣環(huán)境下暴露8 min。暴露后,分別于1 h、8 h 2個時間點對8組大鼠進行麻醉處死,收集肺組織及BALF。測定大鼠的肺濕干比(W/D)和BALF中的總蛋白含量,并進行肺組織病理學(xué)檢查以及Western blot測定肺組織中的LC3的表達水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn),染毒后1 h各指標變化情況如下:1)給藥對照組和給藥染毒組的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值均顯著低于相應(yīng)的溶劑對照組和溶劑染毒組,提示肺組織的自噬受到顯著抑制;2)BALF中的總蛋白含量各組間無明顯差異;3)溶劑染毒組與給藥染毒組較較相應(yīng)對照組的W/D比值均顯著升高,但兩組染毒組間無明顯差異,提示PFIB染毒后1 h肺組織出現(xiàn)了明顯肺水腫,但干預(yù)自噬對肺水腫沒有明顯影響。在染毒后8 h,1)兩個給藥組的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值與相應(yīng)的溶劑組比較仍有下降的趨勢,但是無統(tǒng)計學(xué)意義,提示3-MA對肺組織細胞自噬仍有一定抑制作用;2)給藥染毒組的W/D明顯低于溶劑染毒組,但高于給藥對照組,溶劑染毒組顯著高于溶劑對照組;3)BALF中的總蛋白含量結(jié)果中,溶劑染毒組和給藥染毒組均明顯高于相應(yīng)對照組,給藥染毒組與溶劑染毒組比較有下降趨勢,但沒有統(tǒng)計學(xué)意義;4)從肺組織病理學(xué)檢查中看出,給藥染毒組較溶劑染毒組的肺組織血管周圍水腫程度及炎性細胞滲出有所減輕。以上結(jié)果提示3-MA抑制自噬作用明顯,在PFIB急性吸入性肺損傷早期(染毒后1 h)保護作用不明顯,但在后期(染毒后8 h)對PFIB所致的肺損傷具有一定的保護作用。在RAPA誘導(dǎo)自噬的藥物干預(yù)實驗中,48只SPF級雄性大鼠(8周齡,180-200g)同樣隨機分為8組(n=6),分別為溶劑對照1 h組、給藥對照1 h組、溶劑染毒1 h組、給藥染毒1 h組、溶劑對照8 h組、給藥對照8 h組、溶劑染毒8 h組、給藥染毒8 h組。給藥組的給藥方式:從染毒前的第5天開始,按10 mg/kg bw腹腔注射RAPA,每天一次,第5天給藥時間為染毒前30 min。4個溶劑組參照對應(yīng)的給藥方式及體積給予溶劑。染毒方式、取材時間及實驗方法與3-MA實驗相同。應(yīng)用酶聯(lián)接免疫吸附法(ELISA)測定BALF中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量。結(jié)果表明:1)染毒后1 h,給藥染毒組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值顯著高于溶劑染毒組,給藥染毒組也顯著高于給藥對照組,溶劑染毒組也顯著高于溶劑對照組,說明RAPA能明顯誘導(dǎo)自噬,同時也再次驗證了PFIB染毒后自噬活動明顯增強;2)染毒后1 h的W/D、BALF中的總蛋白含量及病理學(xué)檢查和ELISA的結(jié)果,各組間均沒有明顯變化,提示此時肺組織損傷作用不明顯;3)在染毒后8 h,給藥染毒組和給藥對照組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值仍顯著高于相應(yīng)的溶劑染毒組和溶劑對照組,表明在染毒后8 h RAPA對自噬的誘導(dǎo)作用仍十分明顯;4)染毒后8h給藥染毒組的W/D比值顯著低于溶劑染毒組,給藥染毒組的BALF中總蛋白含量也顯著低于溶劑染毒組;組織病理學(xué)檢查顯示給藥染毒組相較于溶劑染毒組肺水腫較輕,PMN及AM滲出較少。5)PFIB染毒后8 h的大鼠BALF中IL-1β、IL-6、TNF-α含量有不同程度的增高,以IL-1β升高最為顯著;給藥染毒8 h組較溶劑染毒8 h組的炎性因子含量顯著性降低,以IL-1β、TNF-α為著。以上結(jié)果表明染毒后8 h給藥染毒組的肺損傷程度比溶劑染毒組輕,提示RAPA對肺組織具有保護效應(yīng)�？偨Y(jié)以上的實驗結(jié)果:1)PFIB所致的ALI中伴有自噬活動的變化,存在消長現(xiàn)象。在起病初期(1 h),Ⅰ型及Ⅱ型肺泡上皮細胞中自噬活動活躍,并在24 h內(nèi)降至基礎(chǔ)水平。2)自噬對PFIB所致的肺損傷具有促進作用。RAPA及3-MA均能對PFIB所致的ALI具有一定的保護作用。這可能因為自噬對PFIB所致的肺損傷具有促進作用,3-MA通過抑制細胞自噬而發(fā)揮對PFIB急性吸入性肺損傷的保護效應(yīng);而RAPA則因為兼具抗炎作用,并且因其抗炎作用而帶來的對肺組織的保護作用超過了因其誘導(dǎo)自噬而對肺組織的損傷作用,從而減輕PFIB急性吸入性肺損傷。本課題對PFIB所致的ALI提供了新認識,為醫(yī)學(xué)防治提供了參考意見。
[Abstract]:In recent years , the effect of PFIB on the pathogenesis of acute lung injury ( ALI ) caused by PFIB has been studied . In the experiment of 3 - MA inhibition autophagy , 48 SPF - grade male rats ( 8 - week - old and 180 - 200 g ) were randomly divided into 8 groups ( n = 6 ) . The levels of LC3 鈪，

本文編號：1480604