本文關鍵詞： 盤狀結構域受體1 基質金屬蛋白酶-9 腦缺血再灌注損傷 血腦屏障 大鼠　出處：《第四軍醫(yī)大學》2014年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：背景 卒中（尤其是缺血性腦卒中）仍然是威脅我國國民健康的主要殺手之一，在我國，腦卒中具有高發(fā)病率、高患病率、高致殘率和高死亡率的特點；同時，腦卒中給社會帶來了沉重的經濟負擔和巨額的財政支出[2]。目前，臨床中最主要治療卒中的方式是組織型纖溶酶原激活物（tPA）；然而，由于治療時間窗窄[1]，使得這唯一有效的治療干預方式的使用受到了極大的限制。因此，認識卒中發(fā)生的機制并針對性地研究新而有效的干預措施已是迫在眉睫。 血腦屏障(blood brain barrier，BBB)是存在于血液與中樞神經系統(tǒng)之間的一道物理屏障，其主要功能是監(jiān)管出入物質的轉運，保護中樞神經系統(tǒng)免受各種內外因素的傷害；因此，BBB在維持大腦內環(huán)境的穩(wěn)態(tài)中起著重要的作用[3]。然而，血腦屏障的損傷將會導致神經炎性反應、神經退行性變以及中樞神經功能的障礙。引起血腦屏障破壞的因素很多，包括基質金屬蛋白酶（matrixmetallop roteinases, MMPs）、氧化應激、血管生成因子、炎性細胞因子、自身抗體、白細胞粘附因子、免疫細胞的浸潤和各種病原體，它們的共同特點是均會導致血管內皮細胞間緊密連接蛋白表達的減少、基底膜的降解和血腦屏障通透性的增加，進而加重腦損傷的程度[4]。 MMPs是一組Zn2依賴性內肽酶，能夠降解和重塑細胞外基質。各種外源性損傷因子或大腦的缺血再灌注損傷均會引起炎性反應和氧自由基的增加，這些損傷因子激活MMP9、MMP3等基質金屬蛋白酶類后降解BBB的基底膜成分和細胞外基質，進而引起血腦屏障的破壞；而血腦屏障的破壞又可反過來加重腦損傷程度，導致血管源性腦水腫以及一系列的腦損傷[5]。在MMPs中，基質金屬蛋白酶-9（matrixmetalloproteinase-9，MMP-9）與腦梗死程度關系密切[6]。腦缺血/再灌注損傷后表達上調的MMP9通過降解基底膜，破壞血腦屏障，加重腦損傷；因此，抑制腦缺血損傷后MMP-9的表達、保護血腦屏障的完整性可能是減輕腦損傷的重要措施。 盤狀結構域受體1（discoidin domain receptor l，DDR1），屬于圓盤狀的結構域受體酪氨酸激酶類（DDRs），它的主要功能是調控膠原的合成及降解、酶活性并監(jiān)控細胞外基質(extra cellular matrix，ECM)成分的形成；有研究表明，ECM的破壞在腫瘤組織的浸潤和轉移中同樣也起著非常關鍵的作用[7]。以往許多腫瘤研究已證實DDR1可通過與各型膠原（I-V型）的結合介導MMP9的表達和活性，在腫瘤細胞的轉移和擴散中起到了非常關鍵的作用[8,9]；但是DDR1和MMP9的關系在中樞神經系統(tǒng)的研究較少，而在腦缺血損傷后并未見報道；所以我們通過建立大鼠的MCAO模型來觀察腦缺血再灌注損傷后DDR1的表達改變及其對MMP9的影響和機制，并觀察下調DDR1的表達水平對血腦屏障通透性的作用，為缺血性腦損傷后血腦屏障的破壞提供一個新的有效的治療手段。 實驗一、腦缺血再灌注損傷后DDR1蛋白及其磷酸化水平的表達改變 目的：采用大鼠的在體MCAO模型觀察腦缺血及再灌注損傷后DDR1及其磷酸化水平的表達改變情況。 方法：健康成年雄性SD大鼠55只，隨機分為假手術組（sham）、缺血再灌注組（MCAO）、siRNA處理組(siRNA)和siRNA錯配組(siRNA-c)。sham組僅分離血管，不進行線栓阻塞；MCAO組在大腦中動脈阻塞2小時,分別于再灌注3h，6h,12h,24h后1.5倍的正常麻醉劑量下處死大鼠(每個時間點n=5)；siRNA組在MCAO前3天側腦室轉染DDR1-siRNA，于缺血2h再灌注24h后處死大鼠；siRNA-c組在MCAO前3天側腦室轉染DDR1-siRNA-c，于缺血2h再灌注24h后處死大鼠。各組均取同側缺血半暗帶組織進行Western blotting檢測DDR1及其磷酸化水平的表達改變(n=5)；另外,各組于腹腔灌注并固定后連續(xù)冰凍切片，使用DDR1和NeuN的免疫熒光雙標來觀察DDR1在神經元上的表達改變(n=5)。 結果：與假手術組相比，腦缺血再灌注損傷后DDR1蛋白的表達及其磷酸化水平伴隨再灌注時間的持續(xù)明顯上調，并于再灌注24h達到高峰；而通過側腦室注射DDR1的siRNA后，DDR1蛋白的表達及其磷酸化水平相比MCAO組明顯下調,（P0.01MCAO vs.sham； P0.01siRNA vs.MCAO）；另外，注射siRNA-c組DDR1的表達同MCAO組相比無明顯改變（P＞0.05）。 結論：腦缺血再灌注損傷后DDR1及其磷酸化水平隨著再灌注損傷時間的持續(xù)均有不同程度的升高。 實驗二、抑制DDR1的過表達對MMP9表達和活性的影響 目的：采用大鼠在體MCAO模型來觀察抑制DDR1的過表達后MMP9的表達水平和酶蛋白活性的改變情況。 方法：健康成年雄性SD大鼠35只，體重280～320g，分組和處理方法同實驗一，各組取同側缺血半暗帶組織進行Western blotting和明膠酶譜分析法檢測MMP9的酶蛋白表達及其酶活性改變。 結果：正常情況下，，MMP9的表達和活性極低，腦缺再灌注損傷后MMP9的表達和活性伴隨再灌注時間的持續(xù)明顯上調，并于再灌注24h達到高峰。側腦室注射siRNA抑制DDR1的表達后，MMP9的表達和活性明顯下調（P0.01MCAO vs.sham；P0.01siRNA vs.MCAO）；注射siRNA-c組MMP9的表達同MCAO組相比無明顯改變（P＞0.05）。 結論：DDR1siRNA可降低腦缺血損傷后缺血半暗帶區(qū)MMP9的表達和酶活性。 實驗三、下調DDR1蛋白表達及其磷酸化水平對血腦屏障通透性的影響 目的：采用大鼠在體MCAO模型觀察下調DDR1及其磷酸化的表達對血腦屏障通透性、腦梗死容積和神經行為學的影響。 方法：健康成年雄性SD大鼠112只，體重280～320g，分組方法同實驗一。MCAO后，大腦中動脈阻塞2小時,分別于再灌注24h后處死大鼠。采用伊文思藍染色評估血腦屏障的通透性(n=12)、干濕比重法測定腦水含量(n=8)、TTC染色法來評估梗死后的容積百分比(n=8)。 結果：和假手術組相比，腦缺血再灌注損傷后，大鼠的血腦屏障通透性（伊文思藍含量：9.464±0.5342μg/g；腦水含量：83.73±0.44%）升高，神經行為學評分（6.250±0.8864）降低，腦梗死容積(44.75±3.778%)增加；與MCAO組相比，siRNA組大鼠的血腦屏障通透性（伊文思藍含量：4.614±1.142μg/g；腦水含量：79.76±1.05%）降低，神經行為學（12.63±1.408）明顯改善，腦梗死容積（22.45±3.018%）明顯減少（P 0.05），（P0.01MCAO vs.sham； P0.01siRNA vs.MCAO）。 結論：抑制DDR1及其磷酸化的過表達可有效減輕血腦屏障通透性增加，減少腦梗死容積，改善神經行為學評分。 小結 我們的研究結果顯示腦缺血再灌注損傷后DDR1及其磷酸化水平明顯上調、BBB通透性增高、腦梗死容積增大、神經行為學評分降低。抑制DDR1的過表達可減輕MCAO后BBB的通透性，并可減輕缺血再灌注后的腦損傷。進一步的研究發(fā)現，DDR1蛋白可能是通過上調其下游分子MMP9的表達量及酶活性造成缺血后BBB通透性增高和腦損傷的。本研究為我們提供了一個新的思路即：特異性地抑制DDR1的過表達或許就有可能起到保護血腦屏障、降低缺血性卒中的發(fā)生率的作用。本課題為腦缺血后BBB損傷的研究拓寬了思路，下一步我們將從DDR1調控MMP9的中間分子機制入手，進一步揭示DDR1-MMP9通路在腦缺血后BBB損傷中發(fā)揮的作用。
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【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R743.3

【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 何苗;傅仲學;;DDR1a在結腸癌細胞株中的表達及與基質金屬蛋白酶2,9的關系[J];重慶醫(yī)科大學學報;2009年02期

2 ;Relationship between preoperative staging by endoscopic ultrasonography and MMP-9 expression in gastric carcinoma[J];World Journal of Gastroenterology;2007年14期

本文編號：1474159