發(fā)布時間：2018-01-29 05:34

  本文關(guān)鍵詞： 椎間盤退變 BMP-7 功能化自組裝多肽 干細胞趨化 內(nèi)源性修復(fù)　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景隨著人們生活方式的改變以及人口老齡化時代的到來,頸肩腰腿痛(neck shoulder pain or lumbocrural pain, NSCP)目前已成為骨科最常見的疾病,同時這也是導(dǎo)致殘疾及勞動力喪失的主要原因之一。據(jù)最新的流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示,約80%的人在一生中至少會有一次NSCP的經(jīng)歷,受累人群之多給社會帶來了巨大的經(jīng)濟負擔(dān)。因此,尋求針對NSCP的有效治療是當(dāng)前醫(yī)療衛(wèi)生領(lǐng)域亟待解決的重要問題之一。目前普遍認(rèn)為椎間盤退變(intervertebral disc degeneration, IVDD)是引起NSCP的主要原因,但對于椎間盤退變的發(fā)病機制尚不清楚。但是,應(yīng)當(dāng)明確的是椎間盤退變是由遺傳、年齡、應(yīng)力、創(chuàng)傷、職業(yè)等多因素綜合作用引起的。除上述因素作用外,人類的椎間盤內(nèi)脊索細胞及椎間盤血液供應(yīng)在成年后消失使得椎間盤的再生能力要弱于富血管組織。綜上,種種不利因素綜合作用最終導(dǎo)致椎間盤的退變無法逆轉(zhuǎn)。當(dāng)前臨床上針對椎間盤退變引起的NSCP的治療方法主要有保守治療和手術(shù)治療。保守治療具體包括：藥物治療、針灸、理療等,但僅能暫時緩解疼痛癥狀,無法延緩椎間盤的進一步退變。手術(shù)治療常作為保守治療無效后首選的治療手段,具體包括髓核摘除術(shù)、脊柱融合術(shù)、人工椎間盤置換術(shù)等,雖然其療效較持久、穩(wěn)定,但是術(shù)后復(fù)發(fā)及相鄰節(jié)段退變等問題使醫(yī)生及患者均備受困擾。因此,尋求一種新的治療手段是當(dāng)前椎間盤疾病治療的重要任務(wù),生物治療技術(shù)為椎間盤的再生提供了新的治療選擇。研究發(fā)現(xiàn),在椎間盤損傷退變的過程中仍然有內(nèi)源性修復(fù)過程的參與。這種椎間盤內(nèi)源性修復(fù)主要通過兩方面作用來實現(xiàn)。一方面是椎間盤內(nèi)源性細胞發(fā)揮修復(fù)作用,主要通過椎間盤終末細胞(髓核細胞、纖維環(huán)細胞、終板軟骨細胞)分泌細胞外基質(zhì)以及椎間盤干細胞(髓核基質(zhì)干細胞、纖維環(huán)基質(zhì)干細胞、終板軟骨干細胞)分化為椎間盤終末細胞來實現(xiàn)；另一方面是通過骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)發(fā)揮修復(fù)作用,在椎間盤退變的過程中,椎間盤細胞表達并分泌大量生長因子,促進BMSCs從相鄰椎體骨髓穿終板進入椎間盤內(nèi)參與其修復(fù)過程。因此,通過促進椎間盤修復(fù)的正平衡狀態(tài)——激活椎間盤內(nèi)源性細胞的修復(fù)作用以及促進外源性干細胞向椎間盤內(nèi)趨化募集修復(fù)作用,有望成為椎間盤退變生物治療的新方法。骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7 (bone morphogenetic protein-7, BMP-7)作為轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor-β, TGF-β)家族的重要成員,具有與TGF-P相似的成軟骨作用,還能夠激活軟骨細胞及髓核細胞的生物學(xué)功能。一方面,BMP-7在體外能夠促進髓核細胞蛋白聚糖(aggrecan, AGG)、Ⅱ型膠原蛋白(type Ⅱ collagen, COLⅡ)、人性別決定區(qū)Y框蛋白9 (sex determining region Y-box 9, SOX-9)目關(guān)基因的表達以及促進AGG及COLⅡ蛋白的分泌,促進髓核細胞的增殖以及抑制髓核細胞的凋亡等；另一方面,BMP-7能夠促進BMSCs趨化遷移并促進其向軟骨細胞分化。由此,根據(jù)椎間盤內(nèi)源性修復(fù)的特點,若將BMP-7作為候選因子,有望同時發(fā)揮激活椎間盤內(nèi)源性細胞以及募集椎間盤外BMSCs進入椎間盤內(nèi)的作用。然而,單獨使用生長因子半衰期較短,需要往體內(nèi)反復(fù)多次注射才能維持作用。此外,最新動物實驗表明,BMP-7直接注射入椎間盤內(nèi)還存在成骨等風(fēng)險。研究發(fā)現(xiàn)BMP-7具有三個活性片段：SNVI、KPSS、KAIS,在單活性片段作用的情況下,KPSS促進細胞增殖的能力最強,但成骨能力最弱。本課題組前期將BMP-7的三種生物活性片段分別加載至自組裝多肽納米纖維材料RADA16-I的C’末端,組成功能化自組裝多肽納米纖維材料RADA-SNVI, RADA-KPSS, RADA-KAIS。再將三種功能化自組裝多肽納米纖維材料與RADA16-I以1：1體積比例混合后制成新型混合功能化自組裝多肽納米纖維材料RADSNV、RADKPS、RADKAI。在綜合比較之后,體外研究發(fā)現(xiàn)載有KPSS片段的RADKPS促進椎間盤內(nèi)源性細胞分泌AGG及COLII的能力最強,且作用持續(xù)時間較單獨使用BMP-7長。然而,對于RADKPS對BMSCs的趨化遷移分化作用及其在體內(nèi)延緩椎間盤退變的作用尚缺乏相應(yīng)的研究。因此,在前期研究基礎(chǔ)上,本研究擬進一步探究RADKPS的體外及體內(nèi)生物學(xué)作用：1、探究RADKPS體外趨化募集人BMSCs的作用,并利用椎間盤器官培養(yǎng)模型模擬RADKPS在椎間盤內(nèi)促進人BMSCs從終板遷移至髓核的過程。2、探究RADKPS對人BMSCs增殖及向髓核樣細胞分化的作用。3、將RADKPS注入兔退變椎間盤內(nèi),觀察其延緩椎間盤退變的作用,同時予以靜脈注射PKH26標(biāo)記的人BMSCs,觀察RADKPS在體內(nèi)促進BMSCs向椎間盤內(nèi)趨化遷移的作用。第一章RADKPS體外對人BMSCs趨化遷移的影響目的：通過Transwell小室模型及牛尾椎間盤器官培養(yǎng)模型觀察RADKPS在體外對人BMSCs的趨化遷移的影響。方法：1.委托杭州中肽生化有限公司合成RADA16-I及復(fù)合有BMP-7功能片段的RADA-KPSS。將兩種多肽粉末(RADA16-I/RADA16-KPSS)以質(zhì)量體積比為10%的蔗糖水充分溶解,得到濃度均為1mg/mL的兩種多肽溶液。將RADA16-I與RADA-KPSS以等體積比例混合得到RADKPS溶液。在24孔板的孔中加入400μL/孔無血清培養(yǎng)基(serum free dulbecco's modified eagle medium, SF-DMEM)。再將Transwell小室放置于孔中,分別于每孔中加入100 μL體積的RADA16-1或者RADKPS溶液,置于培養(yǎng)箱中孵育30 min后觀察成膠性能,再通過HE染色觀察水凝膠的組織學(xué)結(jié)構(gòu)。2.通過梯度離心法分離人原代BMSCs,體外擴增培養(yǎng)獲取P3代人BMSCs,經(jīng)三系誘導(dǎo)分化(成骨、成脂肪、成軟骨誘導(dǎo))后,茜素紅染色、油紅O染色及COLII免疫細胞化學(xué)染色鑒定成骨、成脂及成軟骨分化能力,將P3代人BMSCs用SF-DMEM制成細胞懸液備用。3.利用Transwell小室模型體外探究RADKPS趨化遷移人BMSCs的能力。實驗分為三組：RADKPS組、RADA16-I組、SF-DMEM組,在24孔板的每孔中加入400μL前述三組溶液。然后將P3代人BMSCs用SF-DMEM配制成濃度為1×105/mL細胞懸液,將100μL此細胞懸液(共1×104個細胞)加入到Transwell小室內(nèi),置于上述24孔板內(nèi)。在培養(yǎng)箱中孵育48 h后,通過結(jié)晶紫染色觀察遷移至Transwell小室濾膜下層細胞,并統(tǒng)計每視野下(×100)細胞的數(shù)量。4.利用牛尾椎間盤器官培養(yǎng)模型觀察RADKPS促進人BMSCs從軟骨終板表面向髓核組織趨化遷移的效果。無菌條件下分離牛尾脊柱功能單位,利用磨鉆去除椎體骨而保留軟骨終板。將一側(cè)纖維環(huán)縱向切開,用髓核鉗摘除少量髓核組織,再將50 μL體積的RADKPS、RADA16-I及SF-DMEM溶液注入髓核缺損處,用縫合線將纖維環(huán)內(nèi)外層縫合,置于6孔板中并在培養(yǎng)箱中預(yù)先孵育24 h。將P3代人BMSCs用PKH26熒光染液標(biāo)記,將標(biāo)記后的細胞(1×106個)接種至牛尾椎間盤軟骨終板上方。待細胞“貼壁”后,加完全培養(yǎng)液至沒過椎間盤,置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h。經(jīng)甲醛固定、石蠟包埋后,沿著椎間盤冠狀面中央進行切片,在熒光倒置顯微鏡下進行觀察,計數(shù)髓核組織中帶紅色熒光的細胞數(shù)量。結(jié)果：RADKPS及RADA16-I在體外接觸無血清培養(yǎng)液后均能迅速成膠,同時HE染色觀察提示多肽支架結(jié)構(gòu)均一且紅染。P3代BMSCs經(jīng)成骨、成脂、成軟骨誘導(dǎo)后,相應(yīng)的茜素紅、油紅O、COLII免疫細胞化學(xué)染色均為陽性。體外遷移實驗進行48 h后,RADKPS組遷移至小室濾膜下層的細胞個數(shù)為115.33±11.30,在RADA16-I組為20.89±5.49,在SF-DMEM組為8.44±2.65,RADKPSRADA16-I SF-DMEM組,兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。在牛尾椎間盤器官培養(yǎng)模型中,結(jié)果顯示在冠狀位正中切面上,RADKPS組髓核組織內(nèi)的人BMSCs數(shù)量為41.75±10.81,而在RADA16-I與SF-DMEM組分別為16.25±6.13與10.00±4.16,RADKPS組高于其余兩組(P0.05), RADA16-I與SF-DMEM組無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。結(jié)論：RADKPS及RADA16-I在Transwell小室模型中均能促進人BMSCs的趨化遷移,且RADKPS的作用要優(yōu)于RADA16-I,而在牛尾椎間盤器官培養(yǎng)模型中,僅RADKPS能夠促進人BMSCs向椎間盤內(nèi)遷移。第二章RADKPS對人BMSCs向髓核細胞分化的影響目的：觀察RADKPS對人BMSCs的活性、增殖及向髓核樣細胞分化的作用。方法：1.用完全培養(yǎng)基將P3代人BMSCs配成指定密度的細胞懸液(不同檢測配不同密度),與RADKPS或RADA16-I分別以1：5體積比例混合構(gòu)建細胞-水凝膠復(fù)合物。通過FDA/PI染液檢測細胞-水凝膠復(fù)合物在培養(yǎng)7天后的活性,同時通過MTT法檢測細胞-水凝膠復(fù)合物培養(yǎng)12 h、3天及7天時細胞增殖的情況。2.按照步驟1構(gòu)建細胞-水凝膠復(fù)合物,體外培養(yǎng)21天,通過實時熒光定量PCR檢測髓核細胞表型SOX-9、COLⅡ、碳酸酐酶-12 (carbonic anhydrase-12, CA-12)、角蛋白-19 (Keratin-19, KRT-19)、AGG的mRNA相對表達量。再通過酶聯(lián)免疫分析(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)檢測細胞-水凝膠復(fù)合物培養(yǎng)7天,21天時COLII及AGG的含量。結(jié)果：細胞-水凝膠復(fù)合物在體外培養(yǎng)7天時,RADKPS及RADA16-I均使細胞活性維持在90%左右。MTT法細胞增殖檢測顯示在體外培養(yǎng)12 h及3天時,RADKPS組與RADA16-I組細胞數(shù)量無明顯差異(P0.05),第7天時細胞數(shù)量在RADKPS組多于RADA16-I組(P0.05)。在體外培養(yǎng)21天時,PCR檢測RADKPS組的人BMSCs表達SOX-9、COLⅡ、CA-12、KRT-19及AGG的mRNA水平均高于RADA16-I組(P0.05)。ELISA檢測提示在體外培養(yǎng)7天時,RADKPS組COLII的含量僅輕度高于RADA16-I組,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),而在體外培養(yǎng)21天時,RADKPS組COLII的含量高于RADA16-I組(P0.05)。在第7天,21天時,RADKPS組AGG的含量均高于RADA16-I組(P0.05)。結(jié)論：與RADA16-I相比,載有BMP-7功能短肽片段的RADKPS在體外能夠維持人BMSCs的活性并促進其增殖能力,同時能夠促進人BMSCs向髓核細胞分化。第三章RADKPS延緩?fù)米甸g盤退變的實驗研究目的：通過動物實驗觀察RADKPS延緩?fù)米甸g盤退變的作用及其在椎間盤內(nèi)募集人BMSCs的作用。方法：1.通過核磁共振檢查(Magnetic Resonance Imaging, MRI)選取椎間盤正常的新西蘭大白兔24只(雌雄不限,體重約2.5-3kg)。肌肉注射麻醉及無菌條件下,經(jīng)腹膜后外側(cè)(左側(cè))入路暴露L2-L5椎體間的3個椎間盤,利用帶21G針頭的10 mL注射器向髓核中央方向穿刺纖維環(huán)至一定深度并在恒定負壓作用下抽吸出適量髓核組織以誘導(dǎo)椎間盤退變。2.在造模手術(shù)4周后,通過X線檢查及MRI掃描對兔椎間盤退變程度進行評估,根據(jù)退變腰椎間盤核磁Pfirrmann分級,選擇椎間盤退變程度在Ⅱ-Ⅲ級的兔子納入后續(xù)治療干預(yù)實驗。將同一兔子的退變椎間盤(L2-L5)及L5-6正常椎間盤分成以下四組：PBS緩沖液(L2-L3)、RADA16-I溶液(L3-L4)、RADKPS溶液(L4-L5),L5-6椎間盤作為正常對照組。在肌肉注射麻醉及無菌條件下,經(jīng)腹膜后外側(cè)(右側(cè))入路暴露L2-L5節(jié)段間的三個椎間盤,用Hamilton微量注射器(27G針頭)分別往相應(yīng)椎間盤內(nèi)注射20 μL的PBS緩沖液、RADA16-I溶液RADKPS溶液。在治療干預(yù)術(shù)后4周,將1 mL密度為1×106/mL的PKH26標(biāo)記人BMSCs細胞懸液注入耳緣靜脈。3.在治療干預(yù)術(shù)后4周、16周進行X線檢查及MRI檢查評估不同治療干預(yù)組的效果,X線檢查觀察骨贅形成及相對椎間盤高度指數(shù)(Relative Disc Height Index,%DHI), MRI檢查觀察椎間盤的相對灰度值指數(shù)(Relative Gray Index. RGI)。在治療干預(yù)16周行X線檢查及MRI檢查之后,將實驗動物通過空氣栓塞處死,獲取所有L2-L6椎體間的椎間盤,保留兩端部分椎體骨后置入10%福爾馬林溶液中固定48 h。經(jīng)乙二胺四乙酸二鈉(disodium ethylenediamine tetraacetic acid, EDTA)脫鈣、蠟塊包埋并切片后,一部分切片行番紅O及HE染色觀察組織學(xué)變化,一部分切片行4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)染色后,在熒光顯微鏡下觀察通過靜脈注射的人BMSCs向目標(biāo)椎間盤內(nèi)遷移的情況。另一部分切片行轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的三磷酸脫氧鳥苷-生物素刻痕末端標(biāo)記(transferase-mediated deoxyuridine triphosphate-biotin nick end labeling; TUNEL)熒光染色觀察細胞凋亡情況。將剩余新鮮椎間盤橫行切開取出髓核組織并保存于液氮中,用ELISA檢測定量分析髓核組織COLII及AGG含量。結(jié)果：MRI及X線檢查結(jié)果提示,在造模手術(shù)前及造模手術(shù)4周后,L2-3、L3-4、L4-5節(jié)段椎間盤%DHI及RGI在不同節(jié)段間無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。在治療干預(yù)手術(shù)后4周及16周,X線檢查提示在不同實驗組間%DHI無差異(P0.05),但均顯著低于正常對照組(P0.05)。在治療干預(yù)術(shù)后4周及16周,MRI檢查提示髓核組織RGI在RADKPS組均要高于RADA16-I組及PBS組(P0.05), RADA16-I組相對于PBS組無明顯差異(P0.05),三治療干預(yù)組均顯著低于正常對照組(P0.05)。在治療干預(yù)16周后,番紅O染色提示,正常對照組髓核組織深染,RADKPS組染色強度強于其余兩干預(yù)組。HE染色提示正常對照組椎間盤髓核及纖維環(huán)界限明顯,仍可見團簇樣的巨大細胞群,在RADKPS組髓核組織與纖維環(huán)組織交界仍存在,保留有較多軟骨樣細胞,而在RADA16-I組及PBS組中,髓核及纖維環(huán)的界限不清,軟骨樣細胞逐漸向成纖維樣細胞轉(zhuǎn)變,細胞數(shù)量也逐漸減少。經(jīng)DAPI染色后,通過熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)在RADKPS組見少量PKH26標(biāo)記的人BMSCs呈紅色熒光,細胞核結(jié)構(gòu)正常,而其余各組未見紅色熒光。TUNEL熒光染色顯示,正常對照組髓核組織鮮有凋亡細胞,RADKPS組凋亡細胞占所有髓核細胞的比值要低于RADA16-I組及PBS組(P0.05)。新鮮髓核組織ELISA檢測提示,在治療干預(yù)術(shù)后16周,RADKPS組AGG及COLII的含量均高于RADA16-I及PBS組(P0.05),但低于正常對照組(P0.05)。結(jié)論：與RADA16-I比較,RADKPS能夠延緩?fù)米甸g盤的退變過程,此作用可能是通過減少兔退變椎間盤內(nèi)源性細胞凋亡、促進AGG及COLII的合成分泌以及促進BMSCs向椎間盤內(nèi)遷移實現(xiàn)的。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R681.5

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4 劉q，

本文編號：1472671