本文關(guān)鍵詞： 腳橋被蓋核 低頻電刺激 帕金森病 Catwalk步態(tài)系統(tǒng) 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2014年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景： 帕金森病(Parkinson's disease,PD)是一種以黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元變性、壞死為主要病變的神經(jīng)系統(tǒng)疾病,典型臨床癥狀為靜止性震顫(resting tremor)、肌肉僵直(muscular rigidity)、運(yùn)動(dòng)遲緩(bradykinesia),同時(shí)約半數(shù)以上的PD患者,在晚期會(huì)出現(xiàn)起步困難、姿勢(shì)不穩(wěn)、步態(tài)紊亂等軸性癥狀(Postural instability/gait disorder, PIGD),而這種軸性癥狀嚴(yán)重的影響了患者的生活質(zhì)量,雖然傳統(tǒng)的核團(tuán)毀損術(shù)、多巴胺藥物替代治療及高頻電刺激蒼白球內(nèi)側(cè)部、丘腦底核或丘腦腹側(cè)核均可改善病人典型癥狀,但是對(duì)病人出現(xiàn)的軸性癥狀療效甚微。 Plaha P及其同事在2005年首次報(bào)道了低頻電刺激(low frequency stimulation,LFS)腳橋核(pedunculopontine nucleus,PPN,在鼠類相當(dāng)于腳橋被蓋網(wǎng)狀核,pedunculopontine tegmental nucleus,PPTg,)可明顯改善PD病人的步態(tài)紊亂、姿態(tài)不穩(wěn)等PIGD癥狀,同時(shí)有研究表明,PD狀態(tài)下,PPN的神經(jīng)元會(huì)發(fā)生不同程度變性、凋亡以及殘余神經(jīng)元出現(xiàn)不規(guī)則放電、代償性地異常過(guò)度放電；這些都提示PPN不僅在PD發(fā)病過(guò)程中起著重要作用,而且PPN可能參與運(yùn)動(dòng)功能的調(diào)節(jié),并且這種運(yùn)動(dòng)功能的調(diào)節(jié)可能同PIGD癥狀相關(guān)。隨后PPN作為一種新的靶核團(tuán)受到人們?cè)絹?lái)越多的關(guān)注。大量臨床研究已證實(shí)低頻電刺激PPN可改善PD病人姿勢(shì)不穩(wěn)、步態(tài)紊亂等PIGD癥狀,但是對(duì)于其作用的機(jī)理尚不明確,而低頻電刺激PPN對(duì)動(dòng)物行為學(xué)影響的研究較臨床研究的滯后性,使得闡明這種作用機(jī)理愈發(fā)困難,因此通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討低頻電刺激PPN對(duì)行為學(xué)的影響是極為重要的。 單側(cè)注射6-羥基多巴胺(6-OHDA)同時(shí)在特定的神經(jīng)核團(tuán)植入電極的偏側(cè)PD大鼠模型具有可重復(fù)性,穩(wěn)定性特點(diǎn),這種模型已被證實(shí)可作為研究深部電刺激丘腦底核對(duì)PD大鼠行為學(xué)影響的一種理想的動(dòng)物模型。雖然有大量的行為學(xué)方法用于檢測(cè)偏側(cè)PD大鼠行為學(xué)的改變(如BBB評(píng)分、足跡實(shí)驗(yàn),爬梯實(shí)驗(yàn)及平衡木實(shí)驗(yàn))但這些實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)存在較大的人為主觀性,所得結(jié)論有待進(jìn)一步商榷,因此在行為學(xué)檢測(cè)中盡量客觀的行為學(xué)檢測(cè)方法及指標(biāo)是極為重要的,本實(shí)驗(yàn)擬采用的Catwalk步態(tài)檢測(cè)系統(tǒng)及曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)(open field test),是相對(duì)理想的兩種行為學(xué)檢測(cè)方法,它們極大避免了人為因素對(duì)動(dòng)物行為學(xué)的影響,并且這兩種檢測(cè)方法已被廣泛的用于脊髓損傷、腦缺血、PD等動(dòng)物模型行為學(xué)得檢測(cè),已經(jīng)得到了越來(lái)越多的學(xué)者的認(rèn)可。 目的： 本研究擬采用Catwalk步態(tài)檢測(cè)系統(tǒng)和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)評(píng)估低頻電刺激腳橋被蓋網(wǎng)狀核對(duì)6-OHDA所致偏側(cè)PD大鼠行為學(xué)的影響,為深入研究低頻電刺激腳橋核治療晚期PD提供理論基礎(chǔ)。方法： 1.動(dòng)物分組：32只SD大鼠按完全隨機(jī)數(shù)字表法將其分為對(duì)照組(6-OHDA 組,n=8)、實(shí)驗(yàn)組(6-OHDA電極植入組,n=24)。 2.立體定向手術(shù)及電極植入 大鼠腹腔注射3.6%水合氯醛(100g/ml)麻醉后,固定于立體定向儀上,常規(guī)消毒,剪開頭皮,剝離骨膜,暴露顱骨,將顱骨前后囟調(diào)平。根據(jù)Paxinos and Watson的《大鼠腦立體定向圖譜》確定右側(cè)前腦內(nèi)側(cè)束(medial forebrain bundle,MFB)和PPTg坐標(biāo)(MFB:AP:-1.8mm, ML:-2.1mm, DV:-8.3mm。PPTg: AP:-7.9mm, ML:-2.1mm, DV:-7.0mm),用10μL微量進(jìn)樣器在MFB處注射新鮮配置的含0.02%抗壞血酸鹽的6-OHDA溶液(4μL/10μg),隨后在顯微鏡下將8導(dǎo)鎢絲刺激電極(每根電極尖端直徑為50μm)植入PPTg,用60°左右生理鹽水洗脫電極,牙科水泥固定并堆積成電極連接的平臺(tái)(headstage)。對(duì)照組僅在MFB處注射6-OHDA,骨蠟覆蓋鉆孔,縫合皮膚。各組大鼠在術(shù)后一周恢復(fù)期內(nèi)自由飲食飲水；兩周后自由飲水,每日進(jìn)食量限制在10g左右,以控制體重。 3.PPTg-LFS 大鼠頭部刺激電極通過(guò)導(dǎo)電滑環(huán)與刺激隔離器輸出端連接,刺激器輸出端的電纜套上金屬螺旋管,以防刺激過(guò)程中大鼠對(duì)電纜造成損壞。從8導(dǎo)刺激電極中篩選出兩根最有效的電極作為刺激的正負(fù)極。刺激參數(shù)：?jiǎn)蚊}沖,方波,頻率25Hz,波寬80μs,幅值2-8V。每只大鼠的刺激幅值為個(gè)體刺激閾值的80%。每只大鼠從2V開始給予刺激,以0.1V為單位向上調(diào),刺激時(shí)間少于10s,相鄰刺激間隔至少間隔1min,直到出現(xiàn)刺激副作用時(shí)(比如,大鼠胡須直立、頭部抖動(dòng)等)的幅值為個(gè)體的刺激閾值。 4.行為學(xué)檢測(cè) 所有大鼠在立體定向手術(shù)前1周進(jìn)行Catwalk及曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采集作為行為學(xué)基線值,術(shù)后21天后所有大鼠再行Catwalk及曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采集,術(shù)后四周后6-OHDA電極組行PPTg-LFS時(shí),再次采集行為學(xué)數(shù)據(jù)。 (1)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)：所用裝置為：直徑80cm,高50cm,由工程塑料合金合成的圓柱形礦場(chǎng)反應(yīng)箱(荷蘭Noldus公司)。將大鼠放在反應(yīng)箱的中央部,保持周圍的環(huán)境安靜,光線適中,大鼠先適應(yīng)環(huán)境10min后,記錄5min內(nèi)大鼠移動(dòng)的距離、運(yùn)動(dòng)軌跡及速度。 (2)Catwalk步態(tài)采集：Catwalk步態(tài)分析系統(tǒng)是一種自動(dòng)化的計(jì)算機(jī)輔助的步態(tài)分析技術(shù),它主要由內(nèi)置熒光燈的玻璃板、高頻攝像頭組成。當(dāng)大鼠通過(guò)玻璃板時(shí),熒光會(huì)從底部反射出爪印的形狀,被下方的攝像頭捕捉到,傳送到計(jì)算機(jī),進(jìn)行離線分析。大鼠適應(yīng)性訓(xùn)練一周以后開始記錄數(shù)據(jù),記錄標(biāo)準(zhǔn)為大鼠連續(xù)的、不間斷的通過(guò)通道,并且每次通過(guò)至少有10步,每只大鼠至少記錄三次。 5.免疫組化及尼氏染色(Nissle) 行為學(xué)檢測(cè)后,大鼠腹腔麻醉,將刺激電極通過(guò)牙科水泥固定形成的平臺(tái)與刺激器相連,給予高于個(gè)體閾值的電壓通電,使得電極尖端在腦組織上留下氧化后的痕跡,以確定刺激電極的尖端的位置。隨后對(duì)大鼠開胸,經(jīng)左心室穿刺入主動(dòng)脈進(jìn)行灌注固定：先用0.9%的生理鹽水300ml預(yù)灌注,再用4%多聚甲醛溶液300m1固定,斷頭并完整取出腦組織,置于4%的多甲溶液中24小時(shí)后,再置于30%的蔗糖溶液中,直至腦組織完全下沉。將固定脫水后的腦組織行冰凍切片,片厚約25μm,取黑質(zhì)致密部行絡(luò)氨酸羥化酶免疫組化染色,腳橋核行尼氏染色。 6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用spssl7.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±S),所有大鼠術(shù)前同術(shù)后均數(shù)比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)；6-OHDA電極植入組在PPTg刺激前、后的計(jì)量資料比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn),實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),以P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1. Catwalk檢測(cè)結(jié)果：所有大鼠術(shù)后的速度變化百分比(run speed variation)、雙爪耦合(Couplings,右前→左前,右前→左后,右后→左前,右后→左后)較術(shù)前明顯增加,每秒步數(shù)(Cadence)明顯減少,6-OHDA電極組大鼠行LFS-PPTg時(shí)速度變化百分比及雙爪耦合(右前→左前,右前→左后,右后→左前,右后→左后)較術(shù)后顯著下降,每秒步數(shù)較術(shù)后增加,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 2.曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果：所有大鼠術(shù)后運(yùn)動(dòng)距離較術(shù)前明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),實(shí)驗(yàn)組(6-OHDA電極組)行LFS-PPTg時(shí),運(yùn)動(dòng)距離較術(shù)后有所增加,且差異顯著(P0.05)。 3.實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組行為學(xué)比較：立體定向術(shù)前,實(shí)驗(yàn)組同對(duì)照組所有大鼠在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和Catwalk步態(tài)檢測(cè)所得的行為學(xué)數(shù)據(jù)無(wú)差異(P0.05)；術(shù)后未行電刺激前實(shí)驗(yàn)組同對(duì)照組相比也無(wú)差異(P0.05)。 結(jié)論： 低頻電刺激腳橋被蓋網(wǎng)狀核后,PD大鼠的運(yùn)動(dòng)能力及一些反應(yīng)臨床上PD軸性癥狀的步態(tài)的到改善,說(shuō)明偏側(cè)PD大鼠PPN植入電極的模型同Catwalk及曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)合,能很好的反應(yīng)PD軸性癥狀和運(yùn)動(dòng)能力的改變。這為進(jìn)一步研究LFS-PPN作用機(jī)理提供了很好的行為學(xué)基礎(chǔ),因此這種行為學(xué)同進(jìn)一步的病理生理及同步記錄相關(guān)神經(jīng)元的電生理活動(dòng)相結(jié)合,可能會(huì)為L(zhǎng)FS-PPN作用機(jī)理提供新的理論基礎(chǔ),從而推動(dòng)LFS-PPN在臨床的廣泛應(yīng)用,使飽受軸性癥狀困擾的病人不再深受其害。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R742.5

【參考文獻(xiàn)】

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1 孫兵,惠國(guó)楨,郭禮和,REISER Jakob;慢病毒介導(dǎo)GDNF對(duì)帕金森病的多巴胺能神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用(英文)[J];生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào);2003年10期

2 王述菊;方劍喬;馬駿;王彥春;曾曉玲;周丹;孫國(guó)杰;;電針對(duì)帕金森病模型大鼠中腦黑質(zhì)p38絲裂原活化蛋白激酶的影響[J];中國(guó)針灸;2013年04期

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本文編號(hào)：1464391