本文關(guān)鍵詞： 2 5-己二酮 軸漿轉(zhuǎn)運 神經(jīng)絲 動力蛋白 Live-cell imaging　出處：《山東大學(xué)》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究目的 正己烷[n-hexane]是己烷的五種同分異構(gòu)體中的一種,分子式為CH3(CH2)4CH3,屬于直鏈飽和脂肪烴類,由原油裂解及分餾獲得。外觀無色,有汽油味,分子量為86.17,易燃,易揮發(fā)(沸點68.74℃)。正己烷的急性毒性較低,大鼠經(jīng)口LD50為15-30g/kg。在工業(yè)上主要用作溶劑,常用于配制粘膠以粘合鞋革、箱包,電子信息產(chǎn)業(yè)中常用于生產(chǎn)過程中的擦拭清洗作業(yè),食品制造業(yè)中常用于粗油浸提,另外還用于塑料制造業(yè)的丙烯溶劑回收、化學(xué)實驗中的萃取劑(如：光氣實驗)以及日用化學(xué)品生產(chǎn)時的花香溶劑萃取等。若使用不當(dāng),極易造成中毒。 因正己烷易揮發(fā),其揮發(fā)速度比酒精還要快,所以常經(jīng)呼吸道和皮膚進入人體。短時吸入高濃度正己烷可出現(xiàn)眼及上呼吸道刺激癥狀,出現(xiàn)色覺、視覺障礙,并有麻醉癥狀,如眩暈、頭痛、惡心、共濟失調(diào)等。嚴重者可致昏迷乃至死亡。長期接觸一定量后可出現(xiàn)多發(fā)性周圍神經(jīng)病,可表現(xiàn)為乏力、四肢遠端(尤其下肢)進行性感覺異常、感覺減退。而后有雙下肢無力、肌肉疼痛、萎縮及運動障礙,嚴重者可致癱瘓。毒代動力學(xué)研究表明,2,5-己二酮(2,5-Hexanedione,2,5-HD)是正己烷在體內(nèi)的最終代謝產(chǎn)物,介導(dǎo)了中毒性周圍神經(jīng)病的發(fā)生。形態(tài)學(xué)研究證實：軸突萎縮是正己烷中毒性周圍神經(jīng)病的特異性病理改變,據(jù)此Lopachin等人提出了“軸突萎縮”假說。該假說認為,2,5-HD可作用于骨架蛋白,如神經(jīng)絲(neurofilament,NF)等,引起軸突萎縮,最終導(dǎo)致周圍神經(jīng)受損。而軸突作為神經(jīng)元的突起,必須依賴軸漿轉(zhuǎn)運從神經(jīng)元的胞體部分得到其所需的各種成分。 軸漿轉(zhuǎn)運的物質(zhì)基礎(chǔ)是運輸器利用ATP水解釋放的化學(xué)能,攜帶被轉(zhuǎn)運物質(zhì)沿微管向不同方向(即順向、逆向)進行移動。簡單地講,軸漿轉(zhuǎn)運的完成離不開以下幾方面的內(nèi)容：cargo,即需要運輸?shù)摹柏浳铩�；動力蛋白；軌道；連接蛋白,連接cargo和動力蛋白；輔助分子。越來越多的證據(jù)表明：軸漿轉(zhuǎn)運缺陷是多種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機制之一。 本研究用2,5-HD建立了體外培養(yǎng)的新生乳大鼠背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglia, DRG)細胞和亞慢性中毒大鼠二種模型,以神經(jīng)絲亞單位NF-M的軸漿轉(zhuǎn)運為切入點,從體內(nèi)體外二種角度觀察中毒性神經(jīng)病發(fā)生過程中神經(jīng)絲的軸漿運輸速度、動力蛋白的含量、ATP的合成以及細胞骨架NFs、微管(α-tubulin、 β-tubulin)和微絲(β-actin)蛋白相對含量的變化,確定2,5-HD對神經(jīng)絲軸漿運輸?shù)挠绊?為正己烷職業(yè)中毒的預(yù)防和治療提供可以借鑒的基礎(chǔ)資料。 研究方法 1.出生48小時內(nèi)的SD乳大鼠,無菌條件下取背根神經(jīng)節(jié),酶法消化后建立DRG細胞體外培養(yǎng)模型。 2.MTT法檢測2,5-HD對細胞存活率的影響,確定2,5-HD的染毒劑量。 3.利用電轉(zhuǎn)染法,將pPA-GFP-NF-M和pDsRed二種質(zhì)粒同時轉(zhuǎn)入體外培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元中。 4.2,5-HD染毒24h后,熒光顯微鏡下用活細胞成像(Live-cell imaging)技術(shù),檢測NF-M轉(zhuǎn)運量的變化。 5.收集培養(yǎng)的DRG細胞,加入預(yù)冷的RIPA裂解液(50mM Tris-HCl, pH7.4,150mM NaCl,1%Triton X-100,1%脫氧膽酸鈉,0.1%SDS,1%Protease Inhibitor Cocktail,磷酸酶抑制劑(5mM Na3VO4,10mM Na4P2O7and1mM碘乙酸))中,裂解細胞。收集裂解液,4℃,12,000×g離心10min。吸出上清,用BCA法測定蛋白含量。 6. Western-blotting法測定2,5-HD對DRG細胞中細胞骨架蛋白(NF-H、NF-M、 NF-L、α-tubuln、β-tubulin和β-actin),動力蛋白(kinesin heavy chain (KHC)、 dynein和dynactin p50),以及μ-calpain和FK2含量的影響。 7.使用ATP檢測試劑盒(ATP Assay Kit)測定2,5-HD對DRG細胞內(nèi)ATP含量的影響。 8.雄性Wistar大鼠用300mg/kg-bw的2,5-HD腹腔注射染毒,染毒時間8周(每周染毒5d,每日1次),建立2,5-HD中毒性周圍神經(jīng)病模型。 9.取大鼠大腦、小腦、脊髓和坐骨神經(jīng)組織在勻漿緩沖液(50mM Tris-HCl,pH7.4,150mM NaCl,1%Triton X-100,1%脫氧膽酸鈉,0.1%SDS,1%Protease Inhibitor Cocktail,磷酸酶抑制劑(5mM Na3VO4,10mM Na4P2O7和1mM碘乙酸))中制備勻漿,10,000×g、4℃離心10min,留取上清。采用Western-Blotting技術(shù)研究大鼠大腦、小腦、脊髓和坐骨神經(jīng)組織中細胞骨架蛋白(NF-H、NF-M、NF-L、α-tubulin、β-tubulin和β-actin)和動力蛋白(kinesin heavy chain (KHC)、和dynein)含量的變化。 研究結(jié)果 1.成功建立了乳大鼠背根神經(jīng)節(jié)細胞的體外培養(yǎng)模型。 2.根據(jù)MTT試驗結(jié)果,在16mM以下,2,5-HD對DRG細胞未顯示明顯毒性作用,因此,選定3個作用劑量,分別為4mM、8mM、6mM,加對照組OmM,共4個組別,在后續(xù)試驗中應(yīng)用。 3.活細胞觀察實驗 120min后實驗終止時,0,4,8,16mM2,5-HD組的熒光光密度剩余量分別為64.40±11.04%,71.52±11.64%,77.42±9.24%,81.50±8.58%。結(jié)果說明：2,5-HD給藥組熒光強度減少的量均低于對照組(0mM2,5-HD組),且存在濃度-反應(yīng)關(guān)系,提示：2,5-HD降低了NF-M的轉(zhuǎn)運量,即2,5-HD減慢了NF-M的轉(zhuǎn)運。 4.2,5-HD對DRG細胞中細胞骨架蛋白含量的影響 與對照組相比,4,8,16mM2,5-HD染毒組的細胞中NF-H的蛋白含量分別下降了7%、21%*和33%**,NF-M分別下降了17%*、38%**和41%**,NF-L僅在16mM組下降了25%**(*P0.05,**P0.01)。a-tubulin、βP-tubulin和β-actin的含量與對照組相比無明顯差別(P0.05)。 5.2,5-HD對DRG細胞中軸漿運輸相關(guān)蛋白的影響 與對照組相比,4,8,16mM2,5-HD染毒組的細胞中KHC的蛋白含量分別下降了10%、24%*和36%**,dynactinp50分別增加了43%**、62%**和28%*(*P0.05,**P0.01),dynein含量無明顯改變(P0.05)。 6.2,5-HD對DRG細胞中μ-calpain和FK2蛋白含量的影響 2,5-HD染毒后,DRG細胞中μ-calpain和FK2的含量與對照組相比無明顯差別(P0.05)。 7.2,5-HD對DRG細胞中ATP含量的影響 染毒24h后,對照組的ATP含量為15.9nmol/mg protein,4,8,16mM2,5-HD組則分別為10.7,8.3,7.8nmol/mg protein,有明顯的濃度-反應(yīng)關(guān)系。 8.2,5-HD對大鼠體重增長的影響 在實驗過程中,對照組大鼠體重穩(wěn)定增長,到實驗結(jié)束時動物平均體重增加了77.6%。2,5-HD染毒組大鼠體重增長明顯比對照組慢,至8周實驗結(jié)束時,染毒組大鼠體重僅增加了11.8%。組間動物體重差別達到了58.9%,有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P0.01)。 9.大鼠步態(tài)的觀察 與對照組相比,染毒組大鼠的步態(tài)隨著實驗的進行不斷發(fā)生改變,而且個體間差異極小(標(biāo)準(zhǔn)差很小)。第5周時,染毒組大鼠的步態(tài)評分達到2分(輕度異常)；第7周時,染毒組大鼠已經(jīng)行走困難(平均為3.3分)；第8周實驗結(jié)束時,染毒組大鼠幾乎全部癱瘓(平均為3.93分)。 10.2,5-HD對大鼠大腦組織中細胞骨架蛋白含量的影響 5個對照組間,NF-H的含量無明顯差異(P0.05)。與對照組相比,2,5-HD染毒組大鼠在第2,4,6和8周時,NF-H的蛋白含量分別下降了7%、38%**,61%**和65%**(*P0.05,**P0.01)。 隨著實驗的進行,不同年齡對照組的大鼠大腦組織中NF-M的含量在不斷地增長,以實驗起始時0周(con0周)為100%,第2,4,6,8周對照組大鼠大腦組織中NF-M的含量分別增加了62%,98%,102%和114%,與con0周比,均有極顯著性差異P0.01)。2,5-HD染毒4,6,8周大鼠與同年齡對照組相比,大腦組織中NF-M的含量均顯著降低(P0.01)；2,5-HD染毒2周大鼠與con2周相比,NF-M含量明顯增加(P0.01)。 5個對照組間,NF-L的含量無明顯差異(P0.05)。與對照組相比,2,5-HD染毒組大鼠在第4,6和8周時,NF-L的蛋白含量分別下降了18%**,34%**和36%**(*P0.05,**P0.01)。 5個對照組間,α-tubulin和β-tubulin的含量無明顯差異(P0.05)。與對照組相比,2,5-HD染毒組大鼠在第8周時,α-tubulin的蛋白含量下降了13%*(*P0.05)；β-tubulin的含量無明顯改變(P0.05)。 隨著實驗的進行,不同年齡對照組的大鼠大腦組織中β-actin的含量在不斷地增長,以實驗起始時0周為100%,第2,4,6,8周對照組大鼠大腦組織中β-actin的含量分別增加了0.65%,11%*,15%*和27%**(*P0.05,**P0.01)。2,5-HD染毒2,4,6,8周大鼠與同年齡對照組相比大腦組織中,β-actin含量變化分別是+21%a(增加),+7%a,-12%a(降低)和-34%aa(aP0.05,aaP0.01)。(增加) 11.2,5-HD對大腦組織中軸漿運輸相關(guān)蛋白含量的影響 Con6周和con8周與其它對照組相比,KHC的含量略有降低(分別為27%**和20%*),2,5-HD染毒組與對照組100%相比,KHC的含量也略有降低。因變化趨勢不明顯,所以,組間差異有可能是實驗誤差所致(*P0.05,**P0.01)。 5個對照組間,dynein的含量無明顯差異(P0.05)。與對照組相比,2,5-HD染毒組大鼠在第4,6和8周時,dynein的蛋白含量分別下降了24%*,23%*和12.5%(*P0.05,**P0.01)。 12.2,5-HD對大鼠脊髓組織中細胞骨架蛋白含量的影響 大鼠脊髓組織中細胞骨架蛋白含量的變化趨勢與大腦組織中的變化基本一致,幅度略有區(qū)別。β-actin的含量在脊髓組織各組間無差異(P0.05)。 13.2,5-HD對脊髓組織中軸漿運輸相關(guān)蛋白含量的影響 在脊髓組織中,5個對照組間,KHC和dynein的含量均無明顯差異(P0.05)。與對照組相比,2,5-HD染毒組大鼠在第4,6和8周時,脊髓組織中dynein的蛋白含量分別下降了16%*,33%**和35%**；KHC的蛋白含量分別下降了4.5%,14%,15%和31%*(*P0.05,**P0.01)。 14.2,5-HD對大鼠小腦組織中細胞骨架蛋白含量的影響 小腦組織中,5個對照組間,NF-H、NF-M、NF-L、α-tubulin、β-tubulin和β-actin的含量無明顯差異(P0.05)。與對照組相比,2,5-HD染毒組大鼠小腦組織中3個神經(jīng)絲亞單位NF-H、NF-M、NF-L和β-tubulin、β-actin的蛋白含量發(fā)生了不同程度的下降；但α-tubulin在2,5-HD染毒后相對含量有所上升。 15.2,5-HD對小腦組織中軸漿運輸相關(guān)蛋白含量的影響 小腦組織中KHC和dynein的含量在各組之間無明顯差異(P0.05)。 16.2,5-HD對大鼠坐骨神經(jīng)組織中細胞骨架蛋白含量的影響 坐骨神經(jīng)組織中NF-H和NF-M蛋白含量的變化與大腦組織中的變化基本一致；NF-L和β-actin的相對含量在各組間無明顯差異(P0.05)；β-tubulin的含量略有增加。 17.2,5-HD對大鼠坐骨神經(jīng)組織中軸漿運輸相關(guān)蛋白含量的影響 在坐骨神經(jīng)組織中,5個對照組間,KHC和dynein的含量均無明顯差異(P0.05)。與對照組相比,2,5-HD染毒組大鼠在第4,6和8周時,脊髓組織中dynein的蛋白含量分別下降了30%**,44%**和28%**；KHC的蛋白含量第2,4,6和8周分別下降了14%、30%**,35%**和57%**(*P0.05,**P0.01)。 結(jié)論 1.2,5-HD明顯減慢了NF-M在體外培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元軸突中的轉(zhuǎn)運。 2.在體外培養(yǎng)的DRG細胞中,2,5-HD染毒可導(dǎo)致軸漿運輸動力蛋白和ATP的含量發(fā)生降低,同時神經(jīng)絲蛋白的相對含量也明顯降低,這些因素的改變可能和NF-M的運輸減慢有關(guān)。 3.動物在體實驗證實：2,5-HD染毒可以導(dǎo)致大鼠大腦、小腦、脊髓和坐骨神經(jīng)組織中KHC和dynein的含量降低,且越接近神經(jīng)的遠端,這種變化越明顯。同時在上述神經(jīng)組織中神經(jīng)絲的含量也明顯降低,這可能與2,5-HD中毒性周圍神經(jīng)病表現(xiàn)的軸漿運輸障礙有關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R114

【參考文獻】

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本文編號：1456161