本文關(guān)鍵詞： 組織蛋白酶K 牙齒發(fā)育 成釉細(xì)胞 釉基質(zhì)蛋白 釉原蛋白 基因敲除小鼠　出處：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：組織蛋白酶K(cathepsin K,CTSK)于1995年首先被發(fā)現(xiàn)存在于兔的破骨細(xì)胞中。早先的研究認(rèn)為CTSK主要在破骨細(xì)胞中表達(dá),并通過在酸性環(huán)境下降解Ⅰ型膠原、骨橋蛋白等骨基質(zhì)蛋白參與破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收。CTSK基因位于人類1號染色體,其突變將導(dǎo)致致密性成骨不全(pycnodysostosis)。其典型癥狀除骨密度增高、頻發(fā)骨折、指/趾骨末端溶骨等骨骼異常之外,通常還會表現(xiàn)有牙釉質(zhì)發(fā)育障礙、牙髓腔或根管閉鎖以及牙骨質(zhì)增厚等牙體硬組織異常,但其機(jī)制尚不清楚,甚至目前尚未見到CTSK在牙齒發(fā)育過程中表達(dá)模式及作用的研究報道�？紤]到骨組織和牙體硬組織(牙釉質(zhì)、牙本質(zhì)和牙骨質(zhì))有著相似的成分及理化性質(zhì),在骨改建過程中發(fā)揮重要作用的CTSK有可能在牙體硬組織發(fā)育過程中亦發(fā)揮重要作用。本課題以研究CTSK在牙齒發(fā)育過程中的表達(dá)模式為切入點(diǎn),利用體外降解實驗尋找CTSK在牙齒發(fā)育過程中可能的作用底物,構(gòu)建Ctsk基因敲除小鼠模型并分析其表型,并通過對CTSK基因突變臨床病例的研究,來探索CTSK在牙體硬組織形成中的作用,為進(jìn)一步研究其在牙齒發(fā)育中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。研究方法:1)25只BALB/c小鼠(18天胎鼠和出生后1天、5天、10天、20天小鼠各5只),用1%戊巴比妥鈉行腹腔內(nèi)注射過量麻醉處死后解剖分離下頜骨,利用免疫組化染色觀察下頜磨牙(牙胚)中CTSK的表達(dá)情況;2)利用釉基質(zhì)蛋白(Emdogain,EMD)酶譜實驗(考馬斯亮藍(lán)染色),檢測不同p H值(p H=4.5、p H=5.5和p H=8)、不同反應(yīng)時間(2 h、6 h、12 h、24 h、48 h)和不同CTSK濃度(上樣量分別為0.015μg、0.045μg、0.075μg、0.105μg、0.15μg和0.225μg)條件下,CTSK對釉基質(zhì)蛋白的降解能力;3)利用體外降解實驗(銀染色),檢測不同酶/底物比和不同反應(yīng)時間(0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、36 h、48 h)條件下,CTSK對釉原蛋白(AMELX)的降解能力;4)委托上海南方模式生物科技發(fā)展有限公司,利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建Ctsk基因敲除小鼠模型;5)利用體視顯微鏡和Micro CT初步觀察Ctsk基因敲除小鼠下頜骨和牙齒的形態(tài)與結(jié)構(gòu);6)通過病史采集、體格檢查、病理檢查、X線檢查、頜面部CBCT等檢查和CTSK基因測序?qū)?例致密性成骨不全患者進(jìn)行臨床研究和基因分析。研究結(jié)果:1)在小鼠磨牙牙胚發(fā)育過程中,從前成釉細(xì)胞到成熟晚期的成釉細(xì)胞均表達(dá)CTSK,表達(dá)強(qiáng)度呈弱-強(qiáng)-弱的變化;2)在牙本質(zhì)礦化階段的成牙本質(zhì)細(xì)胞中可以檢測到CTSK的強(qiáng)表達(dá),并且這種表達(dá)一直持續(xù)到牙本質(zhì)形成的晚期;3)通過EMD酶譜實驗,發(fā)現(xiàn)在p H=4.5的酸性環(huán)境中,CTSK能夠降解商品化的釉基質(zhì)蛋白,其酶解能力隨著作用時間和CTSK濃度的增加而增強(qiáng);4)通過體外降解實驗,發(fā)現(xiàn)CTSK可以將釉原蛋白裂解為多個產(chǎn)物,其酶解能力隨著作用時間和CTSK濃度的增加而增強(qiáng);5)成功構(gòu)建了Ctsk-/-小鼠模型,為研究CTSK在牙齒發(fā)育中的作用及作用機(jī)制提供了實驗工具;6)初步觀察到Ctsk-/-小鼠磨牙有類似于成熟不全型釉質(zhì)發(fā)育不全的表現(xiàn),以及下頜第一磨牙髓室牙本質(zhì)增厚、髓室局部閉鎖等牙體硬組織異常表現(xiàn);7)通過體格檢查、影像學(xué)檢查、病理檢查等,發(fā)現(xiàn)該患者具有身材矮小、骨密度增高、鎖骨發(fā)育異常、雙手雙腳短小、指甲發(fā)育異常、指/趾骨末端溶骨、額骨膨隆、顴面部塌陷、上下頜骨發(fā)育不良、下頜角變鈍、腭穹隆消失、上頜牙列缺損、下頜牙列缺失、牙骨質(zhì)增生、牙齒萌出異常、下頜頜骨骨髓炎等致密性成骨不全的典型癥狀;通過基因分析,明確了患者致密性成骨不全的診斷,發(fā)現(xiàn)了CTSK基因5號外顯子上的兩個復(fù)合雜合突變位點(diǎn)(p.Gly146Asp和p.Tyr203His)。研究結(jié)論:本課題首次發(fā)現(xiàn)了CTSK表達(dá)于小鼠磨牙牙體硬組織形成相關(guān)細(xì)胞,首次揭示了CTSK在小鼠磨牙發(fā)育過程中的時空表達(dá)模式及CTSK能夠降解牙體硬組織特異性蛋白——釉原蛋白等釉基質(zhì)蛋白的能力;成功構(gòu)建了Ctsk-/-小鼠模型,為進(jìn)一步研究CTSK在牙齒發(fā)育中的作用及作用機(jī)制提供了實驗工具;并且首次觀察到Ctsk-/-小鼠磨牙具有釉質(zhì)發(fā)育不全、局部髓室閉鎖等牙體硬組織異常表現(xiàn)。與此同時,我們再一次證實CTSK基因突變所致的致密性成骨不全患者表現(xiàn)有包括牙齒發(fā)育異常在內(nèi)的多種牙齒相關(guān)表征。初步證實了CTSK在牙體硬組織形成過程中發(fā)揮作用,為進(jìn)一步揭示CTSK在牙體硬組織形成過程中的作用機(jī)制、解釋致密性成骨不全患者牙體硬組織異常的致病機(jī)理奠定基礎(chǔ)。
[Abstract]:Cathepsin K (cathepsin K CTSK) in 1995 was first found in rabbit osteoclasts. Previous studies indicated that CTSK mainly expressed in osteoclasts, and through the acidic environment degradation of collagen, osteopontin and bone matrix proteins involved in osteoclast mediated bone resorption in human.CTSK gene chromosome 1, the mutation will lead to dense osteogenesis imperfecta (pycnodysostosis). Its typical symptoms in addition to increased bone density, frequent fracture of phalanx bone end soluble skeletal abnormalities, usually also showed enamel dysplasia, pulp cavity and root canal atresia and cementum or thickening of dental hard tissue abnormalities but the mechanism is not clear, even now, has not been reported CTSK expression patterns and the role during tooth development. Taking into account the bone and dental hard tissues (cementum enamel and essence, have the same tooth) And the physical and chemical properties like components in bone remodeling of CTSK play an important role in the process of may also play an important role in the development of dental hard tissues. This paper studied the expression pattern of CTSK in tooth development process as the breakthrough point, using the in vitro degradation substrate for CTSK during tooth development in addition, the construction and analysis of the phenotype of mouse model of Ctsk gene knockout, and through the research on CTSK gene mutation of clinical cases, to explore the formation of CTSK in dental hard tissues, lay the foundation for further study on its role in tooth development mechanism. Methods: 1 BALB/c mice (1) 25 day, 18 days after birth and 5 days, 10 days, 20 days, 5 mice each) with 1% sodium pentobarbital intraperitoneal injection anesthesia overdose mandible were isolated, using immunohistochemical staining (mandibular molar tooth germ) in CTSK. 杈炬儏鍐，

本文編號：1455990