本文關(guān)鍵詞： 癲癇持續(xù)狀態(tài) 神經(jīng)新生 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 樹(shù)突 膜片鉗　出處：《山東大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：[背景]成年神經(jīng)新生是指在胚胎和出生早期發(fā)育停止后仍不斷有新的神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生、并整合至已經(jīng)存在的神經(jīng)回路中的現(xiàn)象。成年神經(jīng)新生在哺乳類動(dòng)物的嗅腦和海馬這兩個(gè)腦區(qū)最為活躍。成年動(dòng)物海馬齒狀回的新生神經(jīng)元參與學(xué)習(xí)、記憶的形成和消退,并且與情緒的調(diào)節(jié)有關(guān)。該部位的成年神經(jīng)新生受到多種生理和病理因素的影響。顳葉癲癇是成年患者中最為常見(jiàn)的癲癇類型,其中30%-40%患者的癇性發(fā)作不能以現(xiàn)有的藥物進(jìn)行有效的控制。癇性活動(dòng),特別是癲癇持續(xù)狀態(tài)(status epilepticus, SE)短暫增強(qiáng)海馬齒狀回顆粒細(xì)胞新生。依據(jù)SE后新生顆粒細(xì)胞胞體遷移的位置可將它們分為正常位置遷移顆粒細(xì)胞和異位遷移顆粒細(xì)胞。大部分異位遷移顆粒細(xì)胞胞體位于門(mén)區(qū),少數(shù)位于分子層。與已經(jīng)存在的顆粒細(xì)胞相比,門(mén)區(qū)異位顆粒細(xì)胞帶有底樹(shù)突的比例增加、靜息膜電位去極化、部分細(xì)胞具有產(chǎn)生自發(fā)／爆發(fā)性放電的能力以及接受相對(duì)較強(qiáng)的興奮性投射,被認(rèn)為有助于癲癇的形成以及癲癇波的擴(kuò)散。盡管SE后遷移到正常位置的新生顆粒細(xì)胞在數(shù)量上遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于異位顆粒細(xì)胞,但由于研究方法的限制,至今對(duì)它們的認(rèn)識(shí)較少。以往的研究多是在未成熟顆粒細(xì)胞進(jìn)行的,而且僅有的電生理學(xué)研究并未發(fā)現(xiàn)SE后正常分布新生顆粒細(xì)胞具有高興奮性�；钚哉{(diào)節(jié)細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白(activity-regulated cytoskeleton-associated protein, Arc)基因是一種即早基因。有充足的證據(jù)表明,無(wú)論是在mRNA還是蛋白水平上的Arc表達(dá)改變都可用于反映神經(jīng)元的活動(dòng)強(qiáng)度。本課題應(yīng)用攜帶綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein, GFP)基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體標(biāo)記新生顆粒細(xì)胞,結(jié)合共聚焦顯微成像、腦片膜片鉗記錄以及Arc免疫熒光染色,分析了SE后新生、正常分布的海馬齒狀回顆粒細(xì)胞在發(fā)育成熟后的樹(shù)突形態(tài)、樹(shù)突棘密度、電生理學(xué)性質(zhì)以及在癲癇發(fā)作間期和癲癇發(fā)作期的細(xì)胞活動(dòng)水平。[主要方法]1.SE的誘導(dǎo)取體重為150-175g的雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠,稱重后,腹腔內(nèi)注射東莨菪堿/特布他林溶液(各2 mg/kg)。半小時(shí)后,按340 mg/kg的劑量腹腔內(nèi)注射匹羅卡品溶液誘導(dǎo)SE。對(duì)照組動(dòng)物注射相應(yīng)容積的生理鹽水。保留Racine癲癇發(fā)作分級(jí)Ⅱ級(jí)或高于Ⅱ級(jí)、發(fā)作時(shí)間持續(xù)2小時(shí)以上的動(dòng)物進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2.逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建將pCMV-VSV-G和pCAG-GFP兩種質(zhì)粒同時(shí)轉(zhuǎn)染至Platinum-GP細(xì)胞,分別于48和72小時(shí)后收集上清液,以超速離心分離、濃縮病毒。隨后,以濃縮病毒感染Platinum-E細(xì)胞系構(gòu)建能夠穩(wěn)定產(chǎn)生CAG-GFP逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。在對(duì)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)后,定期收集上清液,以超速離心法濃縮純化病毒載體。將濃縮后的CAG-GFP逆轉(zhuǎn)錄病毒載體儲(chǔ)藏于-80度保存、備用。3. CAG-GFP逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的齒狀回內(nèi)注射在SE誘導(dǎo)后第5天,腹腔內(nèi)注射苯巴比妥(50 mg/kg)麻醉大鼠,將動(dòng)物固定于小動(dòng)物腦立體定位儀上。對(duì)頭部進(jìn)行消毒后,切開(kāi)皮膚和皮下組織、暴露顱骨。在前囟后3.2 mm、中線右側(cè)2.5 mm處,以顱骨鉆鉆孔,去除小塊顱骨、硬腦膜,插入1微升進(jìn)樣針,進(jìn)針深度為2.4 mm。將1μl病毒載體,以0.1μl/min的速度注射到海馬齒狀回中。注射完畢后,將針頭停在原位15分鐘以防止溶液沿針孔回流。隨后緩慢退出微量進(jìn)樣針,縫合切口。待大鼠蘇醒后將其轉(zhuǎn)移回鼠籠中。4.經(jīng)心臟灌流固定和海馬組織切片的制作病毒載體腦內(nèi)注射至少10周后,腹腔內(nèi)注射苯巴比妥鈉麻醉動(dòng)物,以2%多聚甲醛溶液經(jīng)心臟對(duì)腦進(jìn)行灌流固定。將取出的腦組織置于2%多聚甲醛溶液中在4℃下固定過(guò)夜。經(jīng)梯度沉糖脫水后,以卵白蛋白-明膠-戊二醛混合物包埋含海馬的腦組織塊。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要,將包埋后的腦組織用振蕩式切片機(jī)薄切至100μm或40μm備用。5.樹(shù)突復(fù)雜性以及樹(shù)突棘密度的定量分析對(duì)厚度為100μm、含有GFP陽(yáng)性細(xì)胞的切片,先以兔抗GFP抗體進(jìn)行免疫熒光染色加強(qiáng)GFP熒光。使用下列參數(shù)對(duì)GFP陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行三維序列掃描：20倍物鏡、Zoom為1、掃描間隔為2μm。樹(shù)突復(fù)雜性以Sholl法(Sholl analysis)進(jìn)行定量分析。首先以三維序列掃描文件重建細(xì)胞的三維圖像,然后用‘'ImageJ軟件描畫(huà)出除軸突外的整個(gè)胞體和突起的輪廓,用描畫(huà)后的細(xì)胞圖像進(jìn)行Sholl分析。所有被分析細(xì)胞均位于齒狀回上錐體片。每只動(dòng)物至少掃描3個(gè)細(xì)胞,以這些細(xì)胞所得數(shù)據(jù)的均值代表單個(gè)動(dòng)物顆粒細(xì)胞樹(shù)突復(fù)雜性。對(duì)用于樹(shù)突棘密度分析的細(xì)胞選擇63X物鏡進(jìn)行三維序列掃捕,Zoom掃描間隔分別為4.0和0.12μm,掃描部位為位于中分子層的樹(shù)突中段和外分子層的樹(shù)突末段。對(duì)每只動(dòng)物,選中段和末段樹(shù)突各9段進(jìn)行掃描和定量分析。以三維序列掃描文件建立樹(shù)突三維圖像,用Image J軟件人工計(jì)數(shù)總的樹(shù)突棘和蘑菇狀樹(shù)突棘。用樹(shù)突數(shù)除以相應(yīng)的樹(shù)突長(zhǎng)度計(jì)算樹(shù)突棘密度,表示為樹(shù)突棘數(shù)μm。以9段樹(shù)突段所得密度的均值代表個(gè)體動(dòng)物的樹(shù)突棘密度。6.腦片膜片鉗記錄逆轉(zhuǎn)錄病毒載體注射至少10周后,用乙醚麻醉動(dòng)物,快速斷頭、取腦,在低溫下制成組織塊并將其固定于切片槽底部。用振蕩切片機(jī)制作厚度為410μm的矢狀腦片。將制備好的腦片用預(yù)先加溫至34.5℃、95%O2/5%CO2-飽和的人工腦脊液孵育30分鐘后,轉(zhuǎn)移到室溫、持續(xù)氧和的人工腦脊液中孵育、備用。將單一腦片置于灌流槽底部,以95% O2/5%CO2-飽和的人工腦脊液持續(xù)灌流腦片。以普通熒光照射(X40水鏡頭)齒狀回部位,尋找GFP陽(yáng)性細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)GFP陽(yáng)性細(xì)胞后,即切換到相差模式下觀察,并用CCD相機(jī)將細(xì)胞圖像實(shí)時(shí)顯示在計(jì)算機(jī)屏幕上,然后在室溫下進(jìn)行膜片鉗記錄。記錄的參數(shù)包括自發(fā)和誘發(fā)放電、微小興奮性突觸后電流(mEPSC)和微小抑制性突觸后電流(mIPSC)。7.戊四氮(PTZ)誘導(dǎo)急性癲癇發(fā)作以及Arc的免疫熒光強(qiáng)度比較逆轉(zhuǎn)錄病毒載體注射至少10周后,腹腔內(nèi)注射PTZ (20 mg/kg)誘導(dǎo)癲癇發(fā)作,對(duì)照組動(dòng)物給予等體積/體重的生理鹽水注射。癲癇發(fā)作15分鐘后,腹腔內(nèi)注射地西泮(5 mg/kg)予以終止。地兩泮注射2小時(shí)后,以2%多聚甲醛經(jīng)心臟對(duì)腦進(jìn)行灌流固定、取腦。隨后,將腦組織在同樣濃度的多聚甲醛溶液中固定過(guò)夜后,梯度沉糖、脫水,用振蕩切片機(jī)制作厚度為40μm的冠狀面腦片。用PBS清洗后,將腦片置于封閉液中在4℃下封閉2.5小時(shí)。隨后將腦片轉(zhuǎn)移至兔抗Arc抗體溶液(用封閉液稀釋1000倍)中4℃孵育過(guò)夜。第二天,用PBS清洗后,將腦片置于Alexa Flour 488標(biāo)識(shí)的驢抗兔二抗溶液中在4℃下孵育2.5小時(shí)。洗片后,將腦片置于載玻片上,用含有75%甘油的PBS溶液封片。對(duì)含有GFP陽(yáng)性新生細(xì)胞、經(jīng)Arc免疫熒光染色后的腦片以共聚焦顯微鏡在40倍鏡下進(jìn)行層掃描(Zoom=1.0)。應(yīng)用ImageJ軟件分別對(duì)GFP陽(yáng)性細(xì)胞胞體和GFP陽(yáng)性細(xì)胞周圍10個(gè)GFP陰性顆粒細(xì)胞胞體的Arc熒光強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)定。計(jì)算同一張切片中GFP陽(yáng)性細(xì)胞Arc熒光強(qiáng)度值和周圍GFP陰性細(xì)胞Arc熒光強(qiáng)度均值的比值,以此比值來(lái)評(píng)價(jià)成熟的新生顆粒細(xì)胞和已經(jīng)存在顆粒細(xì)胞的活動(dòng)強(qiáng)度。[主要結(jié)果]1. CAG-GFP逆轉(zhuǎn)錄病毒載體標(biāo)識(shí)新生顆粒細(xì)胞的有效性載體注射1 0周后,在對(duì)照組動(dòng)物和癲癇模型組動(dòng)物都可觀察到胞體位于顆粒細(xì)胞層、樹(shù)突形態(tài)完整、樹(shù)突末梢到達(dá)外分子層的表達(dá)GFP的新生顆粒細(xì)胞。在癲癇模型組動(dòng)物,GFP陽(yáng)性細(xì)胞較為稀疏,部分GFP陽(yáng)性細(xì)胞帶有向門(mén)區(qū)走行的底樹(shù)突。2.癲癇組與對(duì)照組動(dòng)物新生顆粒細(xì)胞成熟后樹(shù)突復(fù)雜性和樹(shù)突棘密度的比較癲癇組與對(duì)照組動(dòng)物相比,兩組動(dòng)物新生顆粒細(xì)胞的樹(shù)突復(fù)雜性沒(méi)有顯著性差異。樹(shù)突棘定量分析發(fā)現(xiàn)在中段樹(shù)突,兩組動(dòng)物的總樹(shù)突棘和蘑菇狀樹(shù)突棘密度相似,但SE組動(dòng)物末段樹(shù)突的蘑菇狀樹(shù)突棘密度較對(duì)照動(dòng)物顯著增加。3.癲癇組與對(duì)照組動(dòng)物新生顆粒細(xì)胞成熟后電生理學(xué)性質(zhì)的比較無(wú)論是在癲癇模型組動(dòng)物還是在對(duì)照組動(dòng)物,成熟后的新生顆粒細(xì)胞在接近靜息膜電位水平均沒(méi)有表現(xiàn)出具有持續(xù)自發(fā)放電的能力。癲癇組動(dòng)物和對(duì)照組動(dòng)物分別有17.6%(3/17)和11.76%(2/17)的成熟顆粒細(xì)胞出現(xiàn)短暫的自發(fā)放電(P1.0)。對(duì)照組動(dòng)物和癲癇組動(dòng)物成熟顆粒細(xì)胞的靜息膜電位水平分別為-76.0±1.1 mV(n=6)和-75.8 mV±0.9 mV(n=6),兩組之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。細(xì)胞內(nèi)注射電流誘發(fā)的動(dòng)作電位參數(shù)包括動(dòng)作電位閾值、幅度、寬度、后去極化電位的幅度和面積在兩組之間也沒(méi)有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在-70 mV,兩組動(dòng)物的mIPSC無(wú)論在頻率、幅度、上升時(shí)間、衰減時(shí)間以及曲線下而積等方面均無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。但與對(duì)照組動(dòng)物相比,癲癇組成熟顆粒細(xì)胞的mEPSC的幅度較對(duì)照組小,而且頻率也有降低的趨勢(shì)。4.癲癇組與對(duì)照組動(dòng)物新生顆粒細(xì)胞成熟后在癲癇發(fā)作間期和癲癇活動(dòng)期細(xì)胞活動(dòng)強(qiáng)度的比較1)在未經(jīng)PTZ誘導(dǎo)的對(duì)照動(dòng)物,Arc整體表達(dá)水平較低,但成熟后的正常遷移新生顆粒細(xì)胞與周圍顆粒細(xì)胞相比,Arc表達(dá)量稍高。2)未經(jīng)PTZ誘導(dǎo)的癲癇組動(dòng)物,成熟的癲癇持續(xù)狀態(tài)后新生顆粒細(xì)胞與周圍已經(jīng)存在顆粒細(xì)胞相比,Arc表達(dá)量極為接近。3)在經(jīng)PTZ誘導(dǎo)的對(duì)照組動(dòng)物,癇性活動(dòng)顯著增加Arc蛋白的表達(dá),但與已存在顆粒細(xì)胞相比,成熟后的新生顆粒細(xì)胞Arc表達(dá)量偏低。在給予PTZ誘導(dǎo)的有自發(fā)癲癇的動(dòng)物,這一趨勢(shì)沒(méi)有出現(xiàn)顯著改變。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明,無(wú)論是在癲癇發(fā)作期還是發(fā)作間期,成熟的癲癇持續(xù)狀態(tài)后新生顆粒細(xì)胞的活動(dòng)度與周圍顆粒細(xì)胞相比并沒(méi)有差異。[結(jié)論]癲癇持續(xù)狀態(tài)后正常遷移的新生顆粒細(xì)胞成熟后與生理?xiàng)l件下新生的同齡顆粒細(xì)胞相比,終末段樹(shù)突蘑菇狀棘密度較高,但微小興奮性突觸后電流的幅度較低,其它參數(shù)包括樹(shù)突復(fù)雜性、抑制性突觸傳遞以及癲癇發(fā)作間期和癲癇發(fā)作期的細(xì)胞活動(dòng)性均無(wú)顯著性差異。以上結(jié)果提示癲癇持續(xù)狀態(tài)后短暫的神經(jīng)新生增強(qiáng)難以維持齒狀回處于高興奮性狀態(tài)。
[Abstract]:Adult neurogenesis is the most common type of epilepsy in adult patients . After half an hour , the SE was induced by intraperitoneal injection of pilocarpine solution at 340 mg / kg . After 48 hours and 72 hours , the supernatant was collected and the supernatant was collected . The supernatant was collected at 48 and 72 hours respectively . Three - dimensional sequence scanning of GFP - positive cells was carried out with the following parameters : 20 - fold objective lens , 2 % polyformaldehyde solution , 1 - microliter injection needle and 2 % polyformaldehyde solution . The brain slices were injected PTZ ( 20 mg / kg ) at 4 鈩，

本文編號(hào)：1454143