本文關(guān)鍵詞： Nrf2 心肌功能異常 自噬 蛋白病 壞死 氧化應(yīng)激　出處：《山東大學(xué)》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景 心力衰竭是由于持續(xù)性異常神經(jīng)激素及機(jī)械應(yīng)力變化引起的,目前仍是全球主要的死亡原因之一。病理性應(yīng)激反應(yīng)如高血壓常引起心肌肥大、心肌細(xì)胞凋亡和纖維化從而改變微血管結(jié)構(gòu)和心室擴(kuò)張進(jìn)而導(dǎo)致心肌功能異常及心力衰竭。然而具體的機(jī)制還不明確。 最近,有人提出氧化應(yīng)激可能是心血管疾病發(fā)生的原因,然而應(yīng)用非選擇性抗氧化應(yīng)激的方法來治療心血管疾病常常是無效甚至還是有害的。因此,更有靶向性的針對氧化應(yīng)激的來源或內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激防御系統(tǒng)或許能成為一種更有效的治療手段。本研究中,我們揭示了Nrf2作為一種可以控制基礎(chǔ)狀態(tài)下及誘導(dǎo)性抗氧化基因和其它細(xì)胞保護(hù)性Ⅱ相解毒酶的表達(dá)從而起到在多種病理情況下對病理性心肌重塑和功能失調(diào)起到負(fù)性調(diào)節(jié)的作用。有報道指出Nrf2在硫化氫介導(dǎo)的心肌保護(hù)中具有關(guān)鍵作用。我們認(rèn)為Nrf2或許可以作為治療心肌細(xì)胞損傷和心功能異常的藥物靶向。盡管研究證實Nrf2對心肌具有明確的保護(hù)作用,但在動物體內(nèi)還未證實心肌細(xì)胞特異型表達(dá)Nrf2和心肌保護(hù)之間的直接關(guān)系如何。 近來越來越多的研究表明由于還原性谷胱甘肽的增加引起還原性應(yīng)激可引起蛋白質(zhì)聚集導(dǎo)致的心肌病的發(fā)生。在蛋白聚集性心肌病中,存在另外一種可能性：Nrf2慢性激活導(dǎo)致氧化應(yīng)激可能是還原性應(yīng)激介導(dǎo)的心力衰竭的主要原因。盡管還不清楚Nrf2是否存在這種“負(fù)面”影響,然而Nrf2能夠參與自噬過程對蛋白聚集體進(jìn)行調(diào)節(jié)。自噬是一個吞噬自身細(xì)胞質(zhì)蛋白或細(xì)胞器并使其包被進(jìn)入囊泡,并與溶酶體融合形成自噬溶酶體,降解其所包裹的內(nèi)容物的過程。自噬和泛素蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)細(xì)胞內(nèi)異常蛋白質(zhì)降解和清除的主要途徑。UPS通常泛素化目的蛋白從而降解可溶性錯誤折疊或損傷的蛋白質(zhì),而自噬可以清除不可溶的泛素化蛋白聚集體。一旦UPS功能受損,泛素化可溶性異常蛋白聚集成不可溶性有毒的蛋白聚集體從而自噬被激活成為體內(nèi)重要的清除異常蛋白質(zhì)的主要途徑。此外在很多心肌病和心力衰竭過程中心肌蛋白酶體往往受損會產(chǎn)生大量的心肌蛋白聚集體,此時心肌細(xì)胞內(nèi)自噬的激活可能對心臟起到保護(hù)性或者損傷性作用。以上表明,在心肌重塑和心力衰竭過程中Nrf2可能通過調(diào)節(jié)自噬來調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)變化。 因此,本研究試圖揭示心肌特異性Nrf2激活對心肌重塑和心功能損傷的影響,明確Nrf2通過調(diào)節(jié)自噬清除蛋白聚集體從而保護(hù)心肌的可能性。本研究結(jié)果表明在心臟中Nrf2持續(xù)性激活有利于通過自噬清除蛋白聚集體從而抵御心功能不全的發(fā)生。此外,Nrf2不能抑制毒性泛素化蛋白質(zhì)引起的心肌細(xì)胞凋亡但能夠通過促進(jìn)自噬清除毒性蛋白聚集體明顯抑制壞死的發(fā)生。 目的 1.明確心肌特異性Nrf2激活對心肌重塑和心功能損傷的影響； 2.揭示Nrf2是否通過自噬清除蛋白聚集體從而起到保護(hù)心肌的作用 方法 1.制備心肌細(xì)胞特異性Nrf2過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠我們用含鼠5.5kbα肌球蛋白重鏈(a-MHC)基因啟動子(Jeffery Robbions博士惠贈)的轉(zhuǎn)基因盒制備了FVB遺傳背景的Nrf2ctg小鼠。 2.主動脈縮窄術(shù)(TAC) 8周齡雄性C57B16/J小鼠(體重30±2g),腹腔注射氯胺酮(80mg/kg)和甲芐噻嗪(5mg/kg)麻醉。胸骨上切跡處水平切口,切開后不需要進(jìn)入胸膜腔就可直接看到橫主動脈弓,從而避免了使用機(jī)械通氣。分離右無名動脈和左頸總動脈之間的主動脈弓,墊扎27-gauge針頭(0.41mm),7-0絲線結(jié)扎,然后抽出墊扎針,縫合切口。假手術(shù)(sham)組不進(jìn)行主動脈弓結(jié)扎,余過程同手術(shù)組。 3.成年小鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng) 肝素抗凝,小鼠麻醉后,開胸快速取出心臟,快速將主動脈固定在膠原酶溶液灌注系統(tǒng)上,消化細(xì)胞外基質(zhì)。主動脈下方剪下心臟,輕輕將其撕碎,含血清的灌注液終止消化。然后心肌細(xì)胞復(fù)鈣,得到鈣耐受心肌細(xì)胞。心肌細(xì)胞孵育在Ca2+濃度逐步升高的溶液中,直至達(dá)到1.2mM Ca2+。將細(xì)胞培養(yǎng)于包被層粘連蛋白的培養(yǎng)皿中使其貼壁。貼壁后去除懸浮細(xì)胞得到心肌細(xì)胞。 4.細(xì)胞死亡檢測 我們應(yīng)用LDH細(xì)胞毒性檢測試劑盒(630117,Clontech)來檢測細(xì)胞死亡。細(xì)胞活性用以下公式計算得出：細(xì)胞活性=(實驗組細(xì)胞裂解液中LDH)/(對照組細(xì)胞裂解液中LDH)×100%.相反,細(xì)胞死亡率=(實驗組上清中LDH釋放量)／(實驗組上清LDH釋放量+細(xì)胞裂解液中LDH量). 5.數(shù)據(jù)分析 結(jié)果 1.成功制備心肌細(xì)胞特異性Nrf2過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠 2.心肌細(xì)胞特異性Nrf2表達(dá)可以有效抑制慢性壓力負(fù)荷引起的心肌重塑和心功能損傷。 3.Nrf2促進(jìn)自噬小體的形成,增強(qiáng)自噬流。 4.Nrf2雖然不能抑制細(xì)胞凋亡但可以通過清除心肌細(xì)胞中泛素化蛋白聚集體從而抑制壞死的發(fā)生。 結(jié)論 1.在小鼠體內(nèi),心肌細(xì)胞特異性Nrf2激活能夠抑制TAC術(shù)后持續(xù)性后負(fù)荷增加導(dǎo)致的心肌氧化應(yīng)激的發(fā)生如心肌凋亡、纖維化、心肌肥大和心功能異常。 2.持續(xù)性Nrf2激活能夠使自噬小體增加從而利于心肌細(xì)胞中泛素化蛋白質(zhì)的清除。 3.在心肌細(xì)胞中Nrf2能夠促進(jìn)自噬小體的形成和自噬流的增加。 4.在心肌細(xì)胞中Nrf2不影響細(xì)胞凋亡但顯著抑制細(xì)胞壞死。 5.Nrf2通過增強(qiáng)自噬介導(dǎo)的泛素化蛋白聚集體的清除從而起到細(xì)胞保護(hù)作用。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R541.6

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