本文關(guān)鍵詞： 晚期氧化蛋白產(chǎn)物 小腸上皮細(xì)胞 氧化應(yīng)激 凋亡 緊密連接 MAPK　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景和目的:晚期氧化蛋白產(chǎn)物(Advanced oxidation protein products,AOPPs)是一類含雙酪氨酸的蛋白質(zhì)交聯(lián)產(chǎn)物,于1996年由Witko-Sarsat在尿毒癥患者血漿中發(fā)現(xiàn),它是氧化應(yīng)激過程中由激活的中性粒細(xì)胞髓過氧化物酶產(chǎn)生的次氯酸(HC1O)氧化蛋白質(zhì)(主要為白蛋白)而形成的,主要包含兩種不同的分子量:670Kda與67Kda,其特征是酸性條件下在340nm有特異吸收峰。體外用HCIO作用于血漿或血清白蛋白可得到與尿毒癥患者血漿中類似的AOPPs。研究證實(shí),血漿AOPPs水平與新喋呤、二酪氨酸、戊糖素等氧化應(yīng)激標(biāo)志物呈正相關(guān),與谷胱甘肽過氧化物酶等抗氧化劑呈負(fù)相關(guān),被認(rèn)為是一種良好的氧化損傷的敏感標(biāo)志物。AOPPs不僅是氧化損傷的標(biāo)志物,還可作為一類致病介質(zhì)發(fā)揮廣泛的病理作用,參與人類多種疾病的發(fā)生與發(fā)展。慢性腎衰竭患者的血清AOPPs隨著腎功能惡化呈進(jìn)行性升高,升高的AOPPs破壞腎小球?yàn)V過屏障,加重蛋白尿、腎小球硬化和間質(zhì)纖維化。肝硬化患者血清中同樣存在AOPPs升高,且酒精性肝硬化血清AOPPs水平與Child-Pugh評分呈正相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病患者血清AOPPs水平均明顯升高,Ⅱ型糖尿病患者的循環(huán)AOPPs水平明顯高于Ⅰ型糖尿病患者,且AOPPs可能參與糖尿病微血管并發(fā)癥的發(fā)生。Gamian A等研究表明,AOPPs在克羅恩病(Crohn' s disease, CD)及活動(dòng)性潰瘍性結(jié)腸炎患者血清中顯著增加,且在CD中AOPPs水平與疾病活動(dòng)度有關(guān)(r=0.42)。CD是一種病因未明的慢性復(fù)發(fā)性非特異性腸道炎癥性疾病,病變主要累及胃腸道,并伴有腸外表現(xiàn)及免疫異常。其主要的病因及病理生理學(xué)改變?yōu)?環(huán)境因素作用于遺傳易感者,在腸道菌群的參與下,最終導(dǎo)致固有免疫和適應(yīng)性免疫紊亂及炎癥過程,包括:腸道屏障破壞、小腸上皮細(xì)胞凋亡壞死增加、杯狀細(xì)胞及潘氏細(xì)胞功能失調(diào)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、炎癥因子釋放、白細(xì)胞遷移及滯留、有缺陷的未折疊蛋白反應(yīng)及自噬、模式識(shí)別受體對微生物識(shí)別受損、效應(yīng)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞失衡等。越來越多的研究表明,CD患者體內(nèi)普遍存在以氧化/抗氧化失衡為特征的氧化應(yīng)激,作為氧化應(yīng)激的后果,AOPPs可能是調(diào)控CD各種病理生理學(xué)改變的重要因素,但是其具體作用及機(jī)制尚不明確。小腸上皮細(xì)胞(Intestinal epithelial cell,IEC)是覆蓋在小腸腔表面的單層柱狀細(xì)胞,是腸粘膜屏障的主要結(jié)構(gòu),阻擋腸腔內(nèi)細(xì)菌、毒素等有害物質(zhì)對腸壁的直接損害。IEC還可以作為非特異性抗原提呈細(xì)胞,參與黏膜固有免疫。緊密連接位于單層柱狀上皮細(xì)胞之間,為一條狹窄的袋狀結(jié)構(gòu),參與腸粘膜屏障的構(gòu)成,調(diào)節(jié)細(xì)胞旁路轉(zhuǎn)運(yùn)并維持上皮細(xì)胞的極性。緊密連接由多種緊密連接蛋白參組成,最重要的密封蛋白(claudin)、閉合蛋白(occluding)、ZO-1。小腸上皮細(xì)胞及細(xì)胞間的緊密連接結(jié)構(gòu)和功能的破壞是CD等疾病的重要病理生理改變:(1)IEC的增殖、凋亡和壞死必須嚴(yán)格調(diào)控以維持小腸粘膜的完整性,研究表明IEC凋亡、壞死與克羅恩病慢性炎癥有關(guān),是CD的重要病理生理變化。(2) IEC參與粘液分泌有關(guān)的基因突變(如MUC1、MUC19、PTGER4等),導(dǎo)致其分泌的粘液減少,粘膜屏障功能減弱。(3)在CD中,由于緊密連接蛋白表達(dá)降低、重分布等導(dǎo)致緊密連接破壞,滲透性增加,腸腔內(nèi)有害物質(zhì)滲入固有層,直接損害腸壁。AOPPs水平在CD患者血清中顯著升高,但其具體作用尚不明確,是否調(diào)控小腸上皮細(xì)胞增殖、凋亡?是否破壞小腸上皮緊密連接?因此,本研究完成以下三個(gè)研究目標(biāo):(1)證實(shí)AOPPs誘導(dǎo)小腸上皮細(xì)胞凋亡及損傷的病理作用;(2)探討AOPPs對小腸緊密連接蛋白的作用;(3)明確AOPPs作用的機(jī)制。材料和方法:1.無內(nèi)毒素AOPPs的制備和鑒定。按照Wittko-Sarsat等介紹的方法,將20mg/mL無內(nèi)毒素大鼠白蛋白(RSA)與40mmol/L次氯酸(HClO)按等體積混合,室溫孵育30min,即制備出RSA:次氯酸摩爾比為1:140的AOPPs。制備的AOPPs在無內(nèi)毒素用磷酸鹽緩沖液(PBS)中透析24h,除去游離的次氯酸。用0.22μm的微孔濾膜過濾除菌后-20℃保存。20mg/mLRSA與PBS等體積混合,作為對照。AOPPs含量測定:以不同濃度氯胺T制備標(biāo)準(zhǔn)曲線,測定酸性條件下340 nm處吸光值。通過鱟試驗(yàn)法檢測,該方法制備的AOPPs無內(nèi)毒素。2.細(xì)胞培養(yǎng)。大鼠小腸隱窩上皮細(xì)胞(IEC-6)、腸上皮Caco-2細(xì)胞株購自上海細(xì)胞庫。培養(yǎng)條件:用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱,待細(xì)胞生長至80%融合時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。3.細(xì)胞增殖。細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板,每孔接種4000個(gè)細(xì)胞,過夜細(xì)胞貼壁后,每孔分別加入RSA、不同濃度的AOPPs來干預(yù)細(xì)胞,按照CCK-8試劑盒的方法,采用紫外分光光度儀分別檢測加入刺激因素前及刺激后24h的光密度值。4.細(xì)胞凋亡檢測。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率IEC-6細(xì)胞以5×105/孔種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板,培養(yǎng)24h后換無血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜,使細(xì)胞同步于G0期,分組如下:(1)以0, 200μg/mL RSA,50, 100, 200, 400μg/mLAOPPs 刺激 48h; (2)以 200μg/mLAOPPs 刺激 0, 24,48,72h; (3)抑制劑分別采用DPI、apocynin、SOD于37℃預(yù)先孵育60min,后以200μg/mLAOPPs刺激48h;用AnnexinV-FITC/PI雙染,流式細(xì)胞儀激發(fā)波長488nm,發(fā)射波長525nm檢測細(xì)胞凋亡率。DAPI染色檢測細(xì)胞核形態(tài)學(xué)變化IEC-6細(xì)胞種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板,細(xì)胞貼壁后換無血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜,使細(xì)胞同步于GO期,以20μg/mLAOPPs刺激0, 24, 48, 72h,刺激結(jié)束,采用DAPI染核,熒光顯微鏡觀察DAPI藍(lán)色熒光,立即拍照,存像。TUNEL檢測小腸組織原位凋亡組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精水化、PBS洗滌、多聚甲醛固定、再洗滌、蛋白酶K通透后,加入rTdT酶和FITC-dUTP混合物,DAPI復(fù)染,激光共聚焦顯微鏡觀察FITC綠色熒光和DAPI藍(lán)色熒光,拍照存像。5. NADPH氧化酶的活化。p47phox的膜遷移IEC-6 接種于 24 孔板,分別用培養(yǎng)基、200μg/mLRSA、200μg/mLAOPPs、AOPPs+apocynin刺激60min,間接免疫熒光法染色p47phox,DAPI復(fù)染細(xì)胞核,熒光顯微鏡觀察p47phox膜遷移。p47phox磷酸化的檢測IEC-6 接種于 6 孔板,用 200μg/mLAOPPs 刺激 0, 5, 15, 30, 60, 120min,收集細(xì)胞總蛋白。經(jīng)免疫沉淀Phosphoserine或p47phox后,用WB檢測p47phox蛋白含量。p47phox,p22phox,gp91phox 表達(dá)IEC-6 接種于 6 孔板,用 200μg/mLAOPPs 刺激 0,1,3,6,12, 24h,提取細(xì)胞總蛋白,WB檢測p22phox、p47phox和gp91phox的表達(dá)。6.IEC-6細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的檢測。IEC-6接種于6孔板,培養(yǎng)24h后換無血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜,使細(xì)胞同步于G0期,分組如下:(1)以培養(yǎng)基,200μg/mLRSA, 50,100, 200,400μg/mLAOPPs 刺激 3h; (2)以 200μg/mLAOPPs 刺激 0, 5, 30, 60, 120min;(3)抑制劑分別采用DPI、apocynin、SOD于37℃預(yù)先孵育60min,后以200μg/ml AOPPs刺激3h,裝載DCFH-DA探針,流式細(xì)胞儀檢測DCF熒光。7. Western blotting (WB)檢測。細(xì)胞經(jīng)AOPPs、RSA、各組抑制劑等刺激后,提取細(xì)胞總蛋白,采用化學(xué)發(fā)光法檢測 MAPK、PARP-1、PAR、casepase-3、cleaved Casepase-3、AIF、β-actin、ZO-1、occludin、claudin-1 等蛋白的表達(dá)。8.核漿分離。使用武漢碧云天公司提供的細(xì)胞核漿分離提取試劑盒。6孔板的細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌及細(xì)胞刮刮取收集之后,離心,棄上清,細(xì)胞沉淀用細(xì)胞漿提取緩沖液(含DTT及蛋白酶抑制劑)于冰上孵育1Omin,加入細(xì)胞裂解液冰上作用1min,4℃ 12,000-16,000g離心5min后收集上清即得到細(xì)胞漿蛋白。收集沉淀,加入細(xì)胞核蛋白抽提試劑,震蕩,冰浴30min, 4℃ 12000-16000g離心10min,收集上清即為細(xì)胞核蛋白。9.免疫熒光檢測。將細(xì)胞懸液種于24孔板,待細(xì)胞貼壁并經(jīng)AOPPs處理后,予多聚甲醛固定、Triton X-100 透膜、5% BSA 封閉、一抗孵育:(AIF、occludin、ZO-1、claudin-1 )。二抗避光孵育、DAPI染核及熒光顯微鏡下觀察,拍照。10.檢測單層細(xì)胞的通透性及上皮跨膜電阻抗(TEER,transepithelial electrical resistance)值。每個(gè)transwell小室的上室種植2.0×106個(gè)細(xì)胞,分別于上室和下室中加入培養(yǎng)液200μL和600μL。取不同的3個(gè)點(diǎn),利用EVOM細(xì)胞電位儀測量細(xì)胞跨膜電阻抗(TEER),將細(xì)胞電阻儀電極的短臂和長臂分別插入上室和下室測定TEER,取平均值。待TEER達(dá)300Ω/cm2后,分別用不同濃度AOPPs處理不同時(shí)間,觀察TEER的變化。采用Fitc～daxtran測單層細(xì)胞的通透性。11.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。雄性正常SD大鼠(購自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心),體重160-200g,在恒溫清潔環(huán)境(南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)飼養(yǎng),自由進(jìn)食及飲水,隨機(jī)分為4組,每組6只,作如下處理:①溶劑組:等體積PBS,腹腔注射,每日一次。②未修飾的RSA組:50mg/kg體重,腹腔注射,每日一次;③AOPPs-RSA 50mg/kg體重,腹腔注射,每日一次;④AOPPs-RSA50mg/kg體重,腹腔注射,apocynin50mg/kg體重,灌胃,均每日一次,按照該劑量注射,可大鼠血漿AOPPs水平比正常大鼠增高0.5倍左右(相當(dāng)于CD患者血清AOPPs的濃度)。于注射12周時(shí)處死大鼠取材。大鼠經(jīng)七氟醚麻醉后,迅速取出小腸及大腸組織。部分腸組織中性福爾馬林固定,石蠟包埋,3μm切片,進(jìn)行HE染色、免疫熒光及免疫組化等檢測。部分腸組織迅速放于液氮中,以提取蛋白,進(jìn)行WB檢測。12. HE染色、PAS染色、AC染色及免疫組化。大鼠小腸組織標(biāo)本經(jīng)脫蠟、水化處理后,予HE染色以判斷AOPPs處理前后小腸的病理改變。經(jīng)PAS染色及AC染色以檢測杯狀細(xì)胞數(shù)量的變化。小腸組織標(biāo)本經(jīng)脫蠟、水化及抗原修復(fù)、阻斷過氧化物酶及血清封閉后,孵育AOPPs、gp91phox、p22phox、p47phox、p-JNK、PARP-1、PAR、AIF一抗及相應(yīng)的二抗,最后經(jīng)DAB染色,驗(yàn)證以上各蛋白表達(dá)情況。13. CD患者標(biāo)本收集及處理選擇2010年01月至2012年12月2年間在南方醫(yī)院多次住院治療并確診為克羅恩病經(jīng)手術(shù)切除的小腸標(biāo)本(共23例)。含有潰瘍、肉芽腫等病變部位進(jìn)行組織學(xué)檢測,以遠(yuǎn)端無明顯病變的小腸組織作為對照(經(jīng)南方醫(yī)院病理科證實(shí)為基本正常的組織)。用于小腸CD患者AOPPs表達(dá)、小腸上皮細(xì)胞凋亡及二者的相關(guān)性分析。采用回顧性調(diào)查方法,記錄并統(tǒng)計(jì)每例患者的一般情況、臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果以及病理或手術(shù)記錄等。14.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次或3次以上,結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,所有統(tǒng)計(jì)結(jié)果應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0完成。多個(gè)樣本均數(shù)的比較采用One-WayANOVA,在比較前先計(jì)算方差齊性,當(dāng)方差齊時(shí)兩兩比較采用LSD法,方差不齊時(shí)采用DunnettsT3法,當(dāng)p0.05時(shí)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異�；颊咝∧c組織AOPPs染色強(qiáng)度與凋亡細(xì)胞數(shù)量相關(guān)性采用Spearman' s相關(guān)分析。結(jié)果:1.AOPPs抑制體外培養(yǎng)的小腸上皮細(xì)胞(IEC-6)增殖CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示,AOPPs抑制了 IEC-6細(xì)胞增殖,隨著濃度的增加AOPPs對細(xì)胞增殖的抑制作用越顯著,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明:3個(gè)實(shí)驗(yàn)組與對照組比較存在差異,而且差異具有顯著性(F=26.017, P0.001)。2. AOPPs誘導(dǎo)小腸上皮細(xì)胞凋亡AOPP刺激IEC-6細(xì)胞后,隨著刺激時(shí)間的延長,DPAI染色顯示細(xì)胞逐漸出現(xiàn)核濃縮、核碎裂等凋亡表現(xiàn)。流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示,AOPPs呈現(xiàn)時(shí)間和劑量依賴性誘導(dǎo)小腸上皮細(xì)胞凋亡。3. AOPPs激活I(lǐng)EC-6細(xì)胞內(nèi)NADPH氧化酶系統(tǒng)在AOPPs刺激下,IEC-6細(xì)胞內(nèi)NADPH氧化酶亞單元p47phox快速磷酸化,磷酸化在AOPPs刺激5min后開始,并在30min時(shí)最明顯,空白對照組及未修飾的RSA組未見到此效應(yīng)。免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)AOPPs促進(jìn)p47phox的膜遷移,AOPPs刺激15min時(shí)可見明顯的p47phox的膜遷移,而RSA刺激組未見到此效應(yīng),apocynin可抑制AOPPs促膜遷移的效應(yīng)。此外,AOPPs刺激1-3h后明顯增加了p22phox、p47phox、gp91phox亞基蛋白表達(dá),刺激24h仍處于高水平。4. AOPPs升高NADPH氧化酶依賴性的ROSAOPPs刺激IEC-6后能顯著促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)ROS的生成。AOPPs呈濃度依賴性促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生,4000μg/mL時(shí)達(dá)對照組的近3倍(P0.001)。IEC-6細(xì)胞內(nèi)的ROS水平隨著AOPPs刺激時(shí)間的延長逐漸升高,刺激2h后,ROS達(dá)對照組的2倍(P0.01)。未被修飾的RSA對ROS的產(chǎn)生無顯著影響(P0.05)。使用NADPH氧化酶抑制劑DPI,apocynin以及ROS清除劑與IEC-6細(xì)胞預(yù)孵育顯著降低了 AOPPs提升IEC-6細(xì)胞ROS的水平(和AOPPs組比,P0.05)。5. AOPPs誘導(dǎo)IEC-6細(xì)胞內(nèi)JNK磷酸化WB實(shí)驗(yàn)顯示,AOPPs刺激IEC-6細(xì)胞30min后,JNK發(fā)生明顯的磷酸化,磷酸化效應(yīng)可持續(xù)至3h (差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.01)。而空白對照組及未修飾RSA組無此效應(yīng)。6.AOPPs通過NADPH氧化酶-ROS-JNK途徑上調(diào)PARP-1的表達(dá)經(jīng)典的依賴caspase-3途徑與新近發(fā)現(xiàn)的由PARP-1介導(dǎo)的非依賴性caspase-3途徑是炎癥損傷、氧化應(yīng)激相關(guān)的凋亡及壞死下游轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。前者以caspase-3前體(35Kda)降解為裂開的caspase-3 (17Kda和19Kda)為特征。后者以PAR形成、NAD+消耗、胞漿AIF向胞核轉(zhuǎn)位為主要特征。為了探討AOPPs誘導(dǎo)IEC-6細(xì)胞凋亡的下游信號(hào)通路,我們采用wesetem檢測了 AOPP-RSA刺激前后 procaspase-3、cleaved caspase-3、PAR及 PARP-1 的表達(dá)變化。結(jié)果顯示,113Kda的全長PARP-1在200μg/mL的AOPPs-RSA刺激后1h即增加,6h達(dá)頂峰,24h仍處于高水平,同時(shí)伴隨著85Kda的PARP-1斷裂帶出現(xiàn)。PAR蛋白表達(dá)的變化與PARP-1基本一致。采用核漿分離提取,我們發(fā)現(xiàn)AOPPs刺激后,IEC-6細(xì)胞核中AIF顯著增加。而伴隨著PARP-1的增加與PAR的形成,細(xì)胞內(nèi)NAD+的濃度下降。此外,35Kda的caspase-3前體在AOPP-RSA刺激1～24h出現(xiàn)裂解,并伴隨著17Kda的裂解型caspase-3的增加。在AOPPs刺激前,用NADPH氧化酶抑制劑(DPI和apocynin)、ROS清除劑(SOD)和JNK特異抑制劑(SP600125)預(yù)孵育1h后或者與IEC-6細(xì)胞一直共孵育,WB檢測顯示各組抑制劑均能顯著抑制AOPPs對PARP-1的上調(diào)作用,當(dāng)抑制劑持續(xù)存在于AOPPs的作用過程時(shí),抑制作用更為顯著。7. AOPPs促進(jìn)大鼠小腸上皮細(xì)胞凋亡,apocynin阻斷AOPPs效應(yīng)上面我們已經(jīng)證實(shí)AOPPs能夠誘導(dǎo)IEC-6細(xì)胞凋亡,為了驗(yàn)證在體內(nèi)AOPPs增加能否誘導(dǎo)小腸上皮細(xì)胞凋亡,我們以SD大鼠為研究模型,應(yīng)用原位TUNEL標(biāo)記法檢測凋亡的小腸上皮細(xì)胞。12周后,AOPPs注射組較未修飾RSA、PBS組凋亡的小腸上皮細(xì)胞數(shù)顯著增加,NADPH氧化酶抑制劑apocynin可減弱AOPPs的促凋亡效應(yīng)。8. AOPPs慢性負(fù)荷導(dǎo)致大鼠小腸杯狀細(xì)胞減少小腸上皮覆蓋在小腸表面,由吸收細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、干細(xì)胞、潘氏細(xì)胞及內(nèi)分泌細(xì)胞構(gòu)成。為了進(jìn)一步探討AOPPs對小腸上皮細(xì)胞凋亡的后果,我們驗(yàn)證了 AOPPs處理后杯狀細(xì)胞的變化。糖原染色(Periodic Acid-Schiff staining,PAS staining)、阿利新藍(lán)染色(Alcian blue staining,AC staning)均顯示 AOPPs長期負(fù)荷導(dǎo)致杯狀細(xì)胞減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。9. AOPPs 組大鼠 NADPH-ROS-JNK-PARP 被激活小腸切片組織學(xué)檢測顯示AOPPs沉積在小腸隱窩與絨毛頂端的上皮細(xì)胞、固有層的淋巴細(xì)胞。為了驗(yàn)證在體內(nèi)AOPPs能否激活NADPH氧化酶,對大鼠小腸組織采用免疫組化原位檢測及對小腸上皮勻漿蛋白進(jìn)行Western blotting分析。結(jié)果顯示AOPP-RSA注射組NADPH氧化酶各亞基p22phox,p47phox,and gp91phox表達(dá)均上調(diào)。而NADPH氧化酶抑制劑apocynin可以明顯阻斷該效應(yīng)。為了驗(yàn)證AOPPs對JNK-PARP-1通路的激活作用,我們采用免疫組化檢測了磷酸化JNK、PARP-1、PAR、AIF的表達(dá)。AOPPs組較生理鹽水組、RSA組顯著激活了 JNK,增加了 PARP-1、PAR的表達(dá),并誘導(dǎo)AIF從細(xì)胞漿向胞核轉(zhuǎn)位。10. AOPPs慢性負(fù)荷誘導(dǎo)炎細(xì)胞浸潤和小腸上皮損傷對小腸及大腸切片系統(tǒng)的組織學(xué)評估顯示:AOPPs可導(dǎo)致小腸發(fā)生如下病理變化:①小腸絨毛變短;②固有層及粘膜下層有大量的淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎細(xì)胞浸潤;③淋巴濾泡增生;④上皮層壞死及剝脫;⑤小腸粘膜糜爛。而apocynin能夠改善上述病理改變。11. CD患者小腸病變上皮細(xì)胞中AOPPs沉積與細(xì)胞凋亡呈正相關(guān)收集CD患者經(jīng)手術(shù)切除的小腸組織,采用免疫組化檢測AOPPs在小腸病變組織中(糜爛、潰瘍、透壁性炎癥及肉芽腫病變等)的表達(dá)情況,用TUNEL檢測小腸上皮細(xì)胞的凋亡。以病變遠(yuǎn)端的正常小腸組織作為對照。結(jié)果顯示AOPPs主要沉積在病變處的小腸上皮細(xì)胞及固有層的炎癥細(xì)胞中,而在對照組中沉積較少。TUNEL陽性的細(xì)胞主要位于病變組織中。此外,AOPPs染色強(qiáng)度與小腸上皮細(xì)胞凋亡呈正相關(guān)。(r=0.568, P0.01)12. AOPPs下調(diào)體外培養(yǎng)的Caco-2細(xì)胞緊密連接蛋白o(hù)ccludin、claudin-1、ZO-1的表達(dá)Caco-2細(xì)胞由于其在培養(yǎng)條件下可自發(fā)進(jìn)行上皮樣分化并可形成緊密連接,其形態(tài)學(xué)、滲透特征等與小腸類似,因此,常作為研究腸粘膜屏障的模型。未經(jīng)處理的Caco-2細(xì)胞中緊密連接蛋白o(hù)ccludin、claudin-1、ZO-1分布在細(xì)胞與細(xì)胞連接處,形態(tài)完整,表達(dá)量高。隨著AOPPs刺激濃度的增加與刺激時(shí)間的延長,緊密連接蛋白的表達(dá)逐漸降低。免疫熒光顯示occludin、ZO-1在細(xì)胞膜上的表達(dá)密度降低,分布不連續(xù),甚至大量缺失。AOPPs處理后Caco-2細(xì)胞TEER值較對照組顯著下降(P0.01 ),通透性顯著升高(P0.01)。13. AOPPs通過激活ERK1/2-MAPK信號(hào)通路破壞緊密連接AOPPs 刺激 Caco-2 細(xì)胞 15min 后 ERK1/2、JNK-MAPK 開始磷酸化,20min達(dá)最高峰,可持續(xù)至60min,之后逐漸降至未處理水平。為了進(jìn)一步明確AOPPs是否通過激活ERK1/2或JNK破壞緊密連接,我們分別使用ERK1/2抑制劑U0126或JNK抑制劑SP600125預(yù)孵育Caco-2細(xì)胞,再觀察AOPPs對緊密連接蛋白表達(dá)的影響,ERK1/2抑制劑U0126能夠抑制AOPPs對緊密連接蛋白的下調(diào)作用(P0.01 ),而JNK抑制劑不能抑制AOPPs的下調(diào)作用。結(jié)論:1. AOPPs以時(shí)間和劑量依賴性的方式誘導(dǎo)小腸上皮細(xì)胞的凋亡。2. AOPPs通過誘導(dǎo)NADPH氧化酶依賴性的ROS生成,激活ROS敏感的JNK通路,上調(diào)PARP-1的表達(dá),后者導(dǎo)致NAD+消耗、PAR形成及AIF核轉(zhuǎn)位,最終引起細(xì)胞凋亡。3.動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)證明AOPPs誘導(dǎo)小腸上皮細(xì)胞凋亡,引起杯狀細(xì)胞減少,并導(dǎo)致小腸組織炎細(xì)胞浸潤和損傷。NADPH氧化酶抑制劑apocynin干預(yù)可以阻斷AOPPs導(dǎo)致的小腸上皮凋亡和損傷效應(yīng)。4. AOPPs在CD患者病變組織中沉積,并且與小腸上皮細(xì)胞凋亡呈正相關(guān)。5. AOPPs通過激活ERK1/2-MAPK信號(hào)通路下調(diào)緊密連接蛋白o(hù)ccludin、ZO-1及claudin-1的表達(dá),破壞小腸上皮緊密連接,使其滲透性增加。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R574

【參考文獻(xiàn)】

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1 Takayuki Motoki;Yoshio Naomoto;Junji Hoshiba;Yasuhiro Shirakawa;Tomoki Yamatsuji;Junji Matsuoka;Munenori Takaoka;Yasuko Tomono;Yasuhiro Fujiwara;Hiroshi Tsuchita;Mehmet Gunduz;Hitoshi Nagatsuka;Noriaki Tanaka;Toshiyoshi Fujiwara;;Glutamine depletion induces murine neonatal melena with increased apoptosis of the intestinal epithelium[J];World Journal of Gastroenterology;2011年06期

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本文編號(hào)：1446830