本文關鍵詞： 晚期氧化蛋白產物 小腸上皮細胞 氧化應激 凋亡 緊密連接 MAPK　出處：《南方醫(yī)科大學》2014年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：背景和目的:晚期氧化蛋白產物(Advanced oxidation protein products,AOPPs)是一類含雙酪氨酸的蛋白質交聯產物,于1996年由Witko-Sarsat在尿毒癥患者血漿中發(fā)現,它是氧化應激過程中由激活的中性粒細胞髓過氧化物酶產生的次氯酸(HC1O)氧化蛋白質(主要為白蛋白)而形成的,主要包含兩種不同的分子量:670Kda與67Kda,其特征是酸性條件下在340nm有特異吸收峰。體外用HCIO作用于血漿或血清白蛋白可得到與尿毒癥患者血漿中類似的AOPPs。研究證實,血漿AOPPs水平與新喋呤、二酪氨酸、戊糖素等氧化應激標志物呈正相關,與谷胱甘肽過氧化物酶等抗氧化劑呈負相關,被認為是一種良好的氧化損傷的敏感標志物。AOPPs不僅是氧化損傷的標志物,還可作為一類致病介質發(fā)揮廣泛的病理作用,參與人類多種疾病的發(fā)生與發(fā)展。慢性腎衰竭患者的血清AOPPs隨著腎功能惡化呈進行性升高,升高的AOPPs破壞腎小球濾過屏障,加重蛋白尿、腎小球硬化和間質纖維化。肝硬化患者血清中同樣存在AOPPs升高,且酒精性肝硬化血清AOPPs水平與Child-Pugh評分呈正相關。研究發(fā)現Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病患者血清AOPPs水平均明顯升高,Ⅱ型糖尿病患者的循環(huán)AOPPs水平明顯高于Ⅰ型糖尿病患者,且AOPPs可能參與糖尿病微血管并發(fā)癥的發(fā)生。Gamian A等研究表明,AOPPs在克羅恩病(Crohn' s disease, CD)及活動性潰瘍性結腸炎患者血清中顯著增加,且在CD中AOPPs水平與疾病活動度有關(r=0.42)。CD是一種病因未明的慢性復發(fā)性非特異性腸道炎癥性疾病,病變主要累及胃腸道,并伴有腸外表現及免疫異常。其主要的病因及病理生理學改變?yōu)?環(huán)境因素作用于遺傳易感者,在腸道菌群的參與下,最終導致固有免疫和適應性免疫紊亂及炎癥過程,包括:腸道屏障破壞、小腸上皮細胞凋亡壞死增加、杯狀細胞及潘氏細胞功能失調、內質網應激、炎癥因子釋放、白細胞遷移及滯留、有缺陷的未折疊蛋白反應及自噬、模式識別受體對微生物識別受損、效應和調節(jié)性T細胞失衡等。越來越多的研究表明,CD患者體內普遍存在以氧化/抗氧化失衡為特征的氧化應激,作為氧化應激的后果,AOPPs可能是調控CD各種病理生理學改變的重要因素,但是其具體作用及機制尚不明確。小腸上皮細胞(Intestinal epithelial cell,IEC)是覆蓋在小腸腔表面的單層柱狀細胞,是腸粘膜屏障的主要結構,阻擋腸腔內細菌、毒素等有害物質對腸壁的直接損害。IEC還可以作為非特異性抗原提呈細胞,參與黏膜固有免疫。緊密連接位于單層柱狀上皮細胞之間,為一條狹窄的袋狀結構,參與腸粘膜屏障的構成,調節(jié)細胞旁路轉運并維持上皮細胞的極性。緊密連接由多種緊密連接蛋白參組成,最重要的密封蛋白(claudin)、閉合蛋白(occluding)、ZO-1。小腸上皮細胞及細胞間的緊密連接結構和功能的破壞是CD等疾病的重要病理生理改變:(1)IEC的增殖、凋亡和壞死必須嚴格調控以維持小腸粘膜的完整性,研究表明IEC凋亡、壞死與克羅恩病慢性炎癥有關,是CD的重要病理生理變化。(2) IEC參與粘液分泌有關的基因突變(如MUC1、MUC19、PTGER4等),導致其分泌的粘液減少,粘膜屏障功能減弱。(3)在CD中,由于緊密連接蛋白表達降低、重分布等導致緊密連接破壞,滲透性增加,腸腔內有害物質滲入固有層,直接損害腸壁。AOPPs水平在CD患者血清中顯著升高,但其具體作用尚不明確,是否調控小腸上皮細胞增殖、凋亡?是否破壞小腸上皮緊密連接?因此,本研究完成以下三個研究目標:(1)證實AOPPs誘導小腸上皮細胞凋亡及損傷的病理作用;(2)探討AOPPs對小腸緊密連接蛋白的作用;(3)明確AOPPs作用的機制。材料和方法:1.無內毒素AOPPs的制備和鑒定。按照Wittko-Sarsat等介紹的方法,將20mg/mL無內毒素大鼠白蛋白(RSA)與40mmol/L次氯酸(HClO)按等體積混合,室溫孵育30min,即制備出RSA:次氯酸摩爾比為1:140的AOPPs。制備的AOPPs在無內毒素用磷酸鹽緩沖液(PBS)中透析24h,除去游離的次氯酸。用0.22μm的微孔濾膜過濾除菌后-20℃保存。20mg/mLRSA與PBS等體積混合,作為對照。AOPPs含量測定:以不同濃度氯胺T制備標準曲線,測定酸性條件下340 nm處吸光值。通過鱟試驗法檢測,該方法制備的AOPPs無內毒素。2.細胞培養(yǎng)。大鼠小腸隱窩上皮細胞(IEC-6)、腸上皮Caco-2細胞株購自上海細胞庫。培養(yǎng)條件:用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱,待細胞生長至80%融合時用于實驗。3.細胞增殖。細胞接種于96孔培養(yǎng)板,每孔接種4000個細胞,過夜細胞貼壁后,每孔分別加入RSA、不同濃度的AOPPs來干預細胞,按照CCK-8試劑盒的方法,采用紫外分光光度儀分別檢測加入刺激因素前及刺激后24h的光密度值。4.細胞凋亡檢測。流式細胞儀檢測細胞凋亡率IEC-6細胞以5×105/孔種于6孔細胞培養(yǎng)板,培養(yǎng)24h后換無血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜,使細胞同步于G0期,分組如下:(1)以0, 200μg/mL RSA,50, 100, 200, 400μg/mLAOPPs 刺激 48h; (2)以 200μg/mLAOPPs 刺激 0, 24,48,72h; (3)抑制劑分別采用DPI、apocynin、SOD于37℃預先孵育60min,后以200μg/mLAOPPs刺激48h;用AnnexinV-FITC/PI雙染,流式細胞儀激發(fā)波長488nm,發(fā)射波長525nm檢測細胞凋亡率。DAPI染色檢測細胞核形態(tài)學變化IEC-6細胞種于24孔細胞培養(yǎng)板,細胞貼壁后換無血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜,使細胞同步于GO期,以20μg/mLAOPPs刺激0, 24, 48, 72h,刺激結束,采用DAPI染核,熒光顯微鏡觀察DAPI藍色熒光,立即拍照,存像。TUNEL檢測小腸組織原位凋亡組織切片經二甲苯脫蠟、梯度酒精水化、PBS洗滌、多聚甲醛固定、再洗滌、蛋白酶K通透后,加入rTdT酶和FITC-dUTP混合物,DAPI復染,激光共聚焦顯微鏡觀察FITC綠色熒光和DAPI藍色熒光,拍照存像。5. NADPH氧化酶的活化。p47phox的膜遷移IEC-6 接種于 24 孔板,分別用培養(yǎng)基、200μg/mLRSA、200μg/mLAOPPs、AOPPs+apocynin刺激60min,間接免疫熒光法染色p47phox,DAPI復染細胞核,熒光顯微鏡觀察p47phox膜遷移。p47phox磷酸化的檢測IEC-6 接種于 6 孔板,用 200μg/mLAOPPs 刺激 0, 5, 15, 30, 60, 120min,收集細胞總蛋白。經免疫沉淀Phosphoserine或p47phox后,用WB檢測p47phox蛋白含量。p47phox,p22phox,gp91phox 表達IEC-6 接種于 6 孔板,用 200μg/mLAOPPs 刺激 0,1,3,6,12, 24h,提取細胞總蛋白,WB檢測p22phox、p47phox和gp91phox的表達。6.IEC-6細胞內活性氧(ROS)的檢測。IEC-6接種于6孔板,培養(yǎng)24h后換無血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜,使細胞同步于G0期,分組如下:(1)以培養(yǎng)基,200μg/mLRSA, 50,100, 200,400μg/mLAOPPs 刺激 3h; (2)以 200μg/mLAOPPs 刺激 0, 5, 30, 60, 120min;(3)抑制劑分別采用DPI、apocynin、SOD于37℃預先孵育60min,后以200μg/ml AOPPs刺激3h,裝載DCFH-DA探針,流式細胞儀檢測DCF熒光。7. Western blotting (WB)檢測。細胞經AOPPs、RSA、各組抑制劑等刺激后,提取細胞總蛋白,采用化學發(fā)光法檢測 MAPK、PARP-1、PAR、casepase-3、cleaved Casepase-3、AIF、β-actin、ZO-1、occludin、claudin-1 等蛋白的表達。8.核漿分離。使用武漢碧云天公司提供的細胞核漿分離提取試劑盒。6孔板的細胞經PBS洗滌及細胞刮刮取收集之后,離心,棄上清,細胞沉淀用細胞漿提取緩沖液(含DTT及蛋白酶抑制劑)于冰上孵育1Omin,加入細胞裂解液冰上作用1min,4℃ 12,000-16,000g離心5min后收集上清即得到細胞漿蛋白。收集沉淀,加入細胞核蛋白抽提試劑,震蕩,冰浴30min, 4℃ 12000-16000g離心10min,收集上清即為細胞核蛋白。9.免疫熒光檢測。將細胞懸液種于24孔板,待細胞貼壁并經AOPPs處理后,予多聚甲醛固定、Triton X-100 透膜、5% BSA 封閉、一抗孵育:(AIF、occludin、ZO-1、claudin-1 )。二抗避光孵育、DAPI染核及熒光顯微鏡下觀察,拍照。10.檢測單層細胞的通透性及上皮跨膜電阻抗(TEER,transepithelial electrical resistance)值。每個transwell小室的上室種植2.0×106個細胞,分別于上室和下室中加入培養(yǎng)液200μL和600μL。取不同的3個點,利用EVOM細胞電位儀測量細胞跨膜電阻抗(TEER),將細胞電阻儀電極的短臂和長臂分別插入上室和下室測定TEER,取平均值。待TEER達300Ω/cm2后,分別用不同濃度AOPPs處理不同時間,觀察TEER的變化。采用Fitc～daxtran測單層細胞的通透性。11.動物實驗。雄性正常SD大鼠(購自南方醫(yī)科大學實驗動物中心),體重160-200g,在恒溫清潔環(huán)境(南方醫(yī)科大學實驗動物中心)飼養(yǎng),自由進食及飲水,隨機分為4組,每組6只,作如下處理:①溶劑組:等體積PBS,腹腔注射,每日一次。②未修飾的RSA組:50mg/kg體重,腹腔注射,每日一次;③AOPPs-RSA 50mg/kg體重,腹腔注射,每日一次;④AOPPs-RSA50mg/kg體重,腹腔注射,apocynin50mg/kg體重,灌胃,均每日一次,按照該劑量注射,可大鼠血漿AOPPs水平比正常大鼠增高0.5倍左右(相當于CD患者血清AOPPs的濃度)。于注射12周時處死大鼠取材。大鼠經七氟醚麻醉后,迅速取出小腸及大腸組織。部分腸組織中性福爾馬林固定,石蠟包埋,3μm切片,進行HE染色、免疫熒光及免疫組化等檢測。部分腸組織迅速放于液氮中,以提取蛋白,進行WB檢測。12. HE染色、PAS染色、AC染色及免疫組化。大鼠小腸組織標本經脫蠟、水化處理后,予HE染色以判斷AOPPs處理前后小腸的病理改變。經PAS染色及AC染色以檢測杯狀細胞數量的變化。小腸組織標本經脫蠟、水化及抗原修復、阻斷過氧化物酶及血清封閉后,孵育AOPPs、gp91phox、p22phox、p47phox、p-JNK、PARP-1、PAR、AIF一抗及相應的二抗,最后經DAB染色,驗證以上各蛋白表達情況。13. CD患者標本收集及處理選擇2010年01月至2012年12月2年間在南方醫(yī)院多次住院治療并確診為克羅恩病經手術切除的小腸標本(共23例)。含有潰瘍、肉芽腫等病變部位進行組織學檢測,以遠端無明顯病變的小腸組織作為對照(經南方醫(yī)院病理科證實為基本正常的組織)。用于小腸CD患者AOPPs表達、小腸上皮細胞凋亡及二者的相關性分析。采用回顧性調查方法,記錄并統計每例患者的一般情況、臨床表現、實驗室檢查結果以及病理或手術記錄等。14.統計學方法所有實驗均重復3次或3次以上,結果以均數±標準差表示,所有統計結果應用統計軟件SPSS13.0完成。多個樣本均數的比較采用One-WayANOVA,在比較前先計算方差齊性,當方差齊時兩兩比較采用LSD法,方差不齊時采用DunnettsT3法,當p0.05時為具有統計學差異。患者小腸組織AOPPs染色強度與凋亡細胞數量相關性采用Spearman' s相關分析。結果:1.AOPPs抑制體外培養(yǎng)的小腸上皮細胞(IEC-6)增殖CCK-8實驗顯示,AOPPs抑制了 IEC-6細胞增殖,隨著濃度的增加AOPPs對細胞增殖的抑制作用越顯著,經統計學分析表明:3個實驗組與對照組比較存在差異,而且差異具有顯著性(F=26.017, P0.001)。2. AOPPs誘導小腸上皮細胞凋亡AOPP刺激IEC-6細胞后,隨著刺激時間的延長,DPAI染色顯示細胞逐漸出現核濃縮、核碎裂等凋亡表現。流式細胞術檢測顯示,AOPPs呈現時間和劑量依賴性誘導小腸上皮細胞凋亡。3. AOPPs激活IEC-6細胞內NADPH氧化酶系統在AOPPs刺激下,IEC-6細胞內NADPH氧化酶亞單元p47phox快速磷酸化,磷酸化在AOPPs刺激5min后開始,并在30min時最明顯,空白對照組及未修飾的RSA組未見到此效應。免疫熒光染色發(fā)現AOPPs促進p47phox的膜遷移,AOPPs刺激15min時可見明顯的p47phox的膜遷移,而RSA刺激組未見到此效應,apocynin可抑制AOPPs促膜遷移的效應。此外,AOPPs刺激1-3h后明顯增加了p22phox、p47phox、gp91phox亞基蛋白表達,刺激24h仍處于高水平。4. AOPPs升高NADPH氧化酶依賴性的ROSAOPPs刺激IEC-6后能顯著促進細胞內ROS的生成。AOPPs呈濃度依賴性促進細胞內ROS的產生,4000μg/mL時達對照組的近3倍(P0.001)。IEC-6細胞內的ROS水平隨著AOPPs刺激時間的延長逐漸升高,刺激2h后,ROS達對照組的2倍(P0.01)。未被修飾的RSA對ROS的產生無顯著影響(P0.05)。使用NADPH氧化酶抑制劑DPI,apocynin以及ROS清除劑與IEC-6細胞預孵育顯著降低了 AOPPs提升IEC-6細胞ROS的水平(和AOPPs組比,P0.05)。5. AOPPs誘導IEC-6細胞內JNK磷酸化WB實驗顯示,AOPPs刺激IEC-6細胞30min后,JNK發(fā)生明顯的磷酸化,磷酸化效應可持續(xù)至3h (差異有統計學意義,P0.01)。而空白對照組及未修飾RSA組無此效應。6.AOPPs通過NADPH氧化酶-ROS-JNK途徑上調PARP-1的表達經典的依賴caspase-3途徑與新近發(fā)現的由PARP-1介導的非依賴性caspase-3途徑是炎癥損傷、氧化應激相關的凋亡及壞死下游轉導通路。前者以caspase-3前體(35Kda)降解為裂開的caspase-3 (17Kda和19Kda)為特征。后者以PAR形成、NAD+消耗、胞漿AIF向胞核轉位為主要特征。為了探討AOPPs誘導IEC-6細胞凋亡的下游信號通路,我們采用wesetem檢測了 AOPP-RSA刺激前后 procaspase-3、cleaved caspase-3、PAR及 PARP-1 的表達變化。結果顯示,113Kda的全長PARP-1在200μg/mL的AOPPs-RSA刺激后1h即增加,6h達頂峰,24h仍處于高水平,同時伴隨著85Kda的PARP-1斷裂帶出現。PAR蛋白表達的變化與PARP-1基本一致。采用核漿分離提取,我們發(fā)現AOPPs刺激后,IEC-6細胞核中AIF顯著增加。而伴隨著PARP-1的增加與PAR的形成,細胞內NAD+的濃度下降。此外,35Kda的caspase-3前體在AOPP-RSA刺激1～24h出現裂解,并伴隨著17Kda的裂解型caspase-3的增加。在AOPPs刺激前,用NADPH氧化酶抑制劑(DPI和apocynin)、ROS清除劑(SOD)和JNK特異抑制劑(SP600125)預孵育1h后或者與IEC-6細胞一直共孵育,WB檢測顯示各組抑制劑均能顯著抑制AOPPs對PARP-1的上調作用,當抑制劑持續(xù)存在于AOPPs的作用過程時,抑制作用更為顯著。7. AOPPs促進大鼠小腸上皮細胞凋亡,apocynin阻斷AOPPs效應上面我們已經證實AOPPs能夠誘導IEC-6細胞凋亡,為了驗證在體內AOPPs增加能否誘導小腸上皮細胞凋亡,我們以SD大鼠為研究模型,應用原位TUNEL標記法檢測凋亡的小腸上皮細胞。12周后,AOPPs注射組較未修飾RSA、PBS組凋亡的小腸上皮細胞數顯著增加,NADPH氧化酶抑制劑apocynin可減弱AOPPs的促凋亡效應。8. AOPPs慢性負荷導致大鼠小腸杯狀細胞減少小腸上皮覆蓋在小腸表面,由吸收細胞、杯狀細胞、干細胞、潘氏細胞及內分泌細胞構成。為了進一步探討AOPPs對小腸上皮細胞凋亡的后果,我們驗證了 AOPPs處理后杯狀細胞的變化。糖原染色(Periodic Acid-Schiff staining,PAS staining)、阿利新藍染色(Alcian blue staining,AC staning)均顯示 AOPPs長期負荷導致杯狀細胞減少,差異有統計學意義(P0.05)。9. AOPPs 組大鼠 NADPH-ROS-JNK-PARP 被激活小腸切片組織學檢測顯示AOPPs沉積在小腸隱窩與絨毛頂端的上皮細胞、固有層的淋巴細胞。為了驗證在體內AOPPs能否激活NADPH氧化酶,對大鼠小腸組織采用免疫組化原位檢測及對小腸上皮勻漿蛋白進行Western blotting分析。結果顯示AOPP-RSA注射組NADPH氧化酶各亞基p22phox,p47phox,and gp91phox表達均上調。而NADPH氧化酶抑制劑apocynin可以明顯阻斷該效應。為了驗證AOPPs對JNK-PARP-1通路的激活作用,我們采用免疫組化檢測了磷酸化JNK、PARP-1、PAR、AIF的表達。AOPPs組較生理鹽水組、RSA組顯著激活了 JNK,增加了 PARP-1、PAR的表達,并誘導AIF從細胞漿向胞核轉位。10. AOPPs慢性負荷誘導炎細胞浸潤和小腸上皮損傷對小腸及大腸切片系統的組織學評估顯示:AOPPs可導致小腸發(fā)生如下病理變化:①小腸絨毛變短;②固有層及粘膜下層有大量的淋巴細胞、漿細胞、中性粒細胞等炎細胞浸潤;③淋巴濾泡增生;④上皮層壞死及剝脫;⑤小腸粘膜糜爛。而apocynin能夠改善上述病理改變。11. CD患者小腸病變上皮細胞中AOPPs沉積與細胞凋亡呈正相關收集CD患者經手術切除的小腸組織,采用免疫組化檢測AOPPs在小腸病變組織中(糜爛、潰瘍、透壁性炎癥及肉芽腫病變等)的表達情況,用TUNEL檢測小腸上皮細胞的凋亡。以病變遠端的正常小腸組織作為對照。結果顯示AOPPs主要沉積在病變處的小腸上皮細胞及固有層的炎癥細胞中,而在對照組中沉積較少。TUNEL陽性的細胞主要位于病變組織中。此外,AOPPs染色強度與小腸上皮細胞凋亡呈正相關。(r=0.568, P0.01)12. AOPPs下調體外培養(yǎng)的Caco-2細胞緊密連接蛋白occludin、claudin-1、ZO-1的表達Caco-2細胞由于其在培養(yǎng)條件下可自發(fā)進行上皮樣分化并可形成緊密連接,其形態(tài)學、滲透特征等與小腸類似,因此,常作為研究腸粘膜屏障的模型。未經處理的Caco-2細胞中緊密連接蛋白occludin、claudin-1、ZO-1分布在細胞與細胞連接處,形態(tài)完整,表達量高。隨著AOPPs刺激濃度的增加與刺激時間的延長,緊密連接蛋白的表達逐漸降低。免疫熒光顯示occludin、ZO-1在細胞膜上的表達密度降低,分布不連續(xù),甚至大量缺失。AOPPs處理后Caco-2細胞TEER值較對照組顯著下降(P0.01 ),通透性顯著升高(P0.01)。13. AOPPs通過激活ERK1/2-MAPK信號通路破壞緊密連接AOPPs 刺激 Caco-2 細胞 15min 后 ERK1/2、JNK-MAPK 開始磷酸化,20min達最高峰,可持續(xù)至60min,之后逐漸降至未處理水平。為了進一步明確AOPPs是否通過激活ERK1/2或JNK破壞緊密連接,我們分別使用ERK1/2抑制劑U0126或JNK抑制劑SP600125預孵育Caco-2細胞,再觀察AOPPs對緊密連接蛋白表達的影響,ERK1/2抑制劑U0126能夠抑制AOPPs對緊密連接蛋白的下調作用(P0.01 ),而JNK抑制劑不能抑制AOPPs的下調作用。結論:1. AOPPs以時間和劑量依賴性的方式誘導小腸上皮細胞的凋亡。2. AOPPs通過誘導NADPH氧化酶依賴性的ROS生成,激活ROS敏感的JNK通路,上調PARP-1的表達,后者導致NAD+消耗、PAR形成及AIF核轉位,最終引起細胞凋亡。3.動物學實驗證明AOPPs誘導小腸上皮細胞凋亡,引起杯狀細胞減少,并導致小腸組織炎細胞浸潤和損傷。NADPH氧化酶抑制劑apocynin干預可以阻斷AOPPs導致的小腸上皮凋亡和損傷效應。4. AOPPs在CD患者病變組織中沉積,并且與小腸上皮細胞凋亡呈正相關。5. AOPPs通過激活ERK1/2-MAPK信號通路下調緊密連接蛋白occludin、ZO-1及claudin-1的表達,破壞小腸上皮緊密連接,使其滲透性增加。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R574

【參考文獻】

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1 Takayuki Motoki;Yoshio Naomoto;Junji Hoshiba;Yasuhiro Shirakawa;Tomoki Yamatsuji;Junji Matsuoka;Munenori Takaoka;Yasuko Tomono;Yasuhiro Fujiwara;Hiroshi Tsuchita;Mehmet Gunduz;Hitoshi Nagatsuka;Noriaki Tanaka;Toshiyoshi Fujiwara;;Glutamine depletion induces murine neonatal melena with increased apoptosis of the intestinal epithelium[J];World Journal of Gastroenterology;2011年06期

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本文編號：1446830