發(fā)布時間：2017-12-03 16:23

  本文關鍵詞：嗎啡戒斷、復吸大鼠不同腦區(qū)肌動蛋白重構及其機制研究

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【摘要】：阿片成癮是一種復雜的、復發(fā)性的腦病,主要表現(xiàn)為強迫性的覓藥行為、無法控制的用藥,以及戒斷后負性情緒狀態(tài)的產(chǎn)生。成癮者在長期戒斷后,當再次使用藥物、遭遇應激事件或接觸藥物濫用的相關環(huán)境時,依然會表現(xiàn)為沖動控制能力的下降、沖動行為增加,并引發(fā)復吸。長期藥物濫用導致的獎賞和記憶神經(jīng)環(huán)路的異常重構被認為是成癮行為形成的關鍵。然而,對成癮行為形成中突觸及結構的可塑性變化尚需進一步闡明。本實驗從骨架肌動蛋白入手,結合動物行為學、分子細胞生物學等方法,研究大鼠嗎啡戒斷和復吸形成過程中肌動蛋白重構的變化及機制,進一步深化對阿片類藥物成癮的分子生物學機制的認識。第一部分嗎啡戒斷及再誘導大鼠不同腦區(qū)肌動蛋白重構及其機制研究目的:研究大鼠嗎啡戒斷及再誘導后不同腦區(qū)肌動蛋白的變化方法:1嗎啡依賴、戒斷和嗎啡再誘導大鼠模型的制備:清潔級雄性SD大鼠48只,按隨機分組原則分組。N2、N4、N5和N6組采用劑量遞增法腹腔注射鹽酸嗎啡7天,以建立嗎啡依賴模型,N1組及N3組給予等體積的生理鹽水。第8-20d,停止注射。第21d,N3組和N4動物,腹腔注射10mg/kg嗎啡;N6組和N5組,先分別右側(cè)腦室注射1μL的生理鹽水和0.5μg/μL Latrunculin A,10min后,再腹腔注射10mg/kg嗎啡;N1組腹腔注射等體積生理鹽水;N2組不做處理。1.1行為學評分:第8-21d,每天觀察20min行為學變化,包括:濕狗樣顫抖、站立、伸展、清理皮毛、吞咽、齒顫、舔陰、腹瀉。第21d,所有組進行行為學評分。所有組動物,在所有測試完成后,立馬戊巴比妥鈉麻醉,斷頭取腦,分離相關腦區(qū):海馬(Hip),前額葉皮質(zhì)(Pfc),紋狀體(Str),伏隔核(NAc)。2 Western-blot檢測腦組織中各種蛋白的表達水平:成癮相關腦區(qū)組織勻漿提取總蛋白,測定其中相關蛋白變化。肌動蛋白分為兩種形式:胞漿可溶性蛋白(G-actin)和細胞骨架相關蛋白(F-actin)。采用不同緩沖液對這兩種蛋白進行分步提取,分別觀察肌動蛋白(G-actin和F-actin)及其結合蛋白(cofilin,drebrin A/E,cortactin,WAVE-2,N-WASP,Calcinerurin A,Profilin-1,ARP2,ARP3,SSH1以及β-actin)表達變化。結果:1不同腦區(qū)在電鏡下的形態(tài)學變化:對照組海馬CA1區(qū)、前額葉皮質(zhì)和伏隔核中,突觸前可見線粒體,有大量突觸小泡,與突觸前膜相比,突觸后膜均勻增厚;啡依賴組各腦區(qū),可見突觸后膜明顯增厚;自然戒斷組,突觸后膜仍明顯增厚。2行為學癥狀評分:嗎啡戒斷14后,恢復正常;再次用嗎啡誘導,行為學評分又顯著升高45%(P0.001)。Latrunculin A阻斷嗎啡再誘導后,行為學評分無顯著性變化。3 Western-blot檢測腦組織中各種蛋白的表達水平3.1 W組與NS/NS組相比:海馬中,總cortactin上調(diào)66%(P0.01);ARP2上調(diào)35%(P0.05)。前額葉皮質(zhì)中,profilin-1下調(diào)27%(P0.01)。紋狀體中,N-WASP下調(diào)20%(P0.05)。伏隔核中,P-cofilin/cofilin的比例下調(diào)20%(P0.01);WAVE-2下調(diào)45%(P0.01)。3.2 M/M組與W組相比:海馬中,F-actin/G-actin比例下調(diào)13%(P0.05);Drebrin A/E與F-actin和G-actin的結合游離比,下調(diào)12%(P0.05);cortactin與F-actin和G-actin的結合游離比,上調(diào)30%(P0.05);SSH1上調(diào)40%(P0.05);P-cofilin/cofilin比例下調(diào)36%(P0.05);N-WASP,上調(diào)42%(P0.05);calcinurin A,上調(diào)13%(P0.05)。前額葉皮質(zhì)中,總drenbrin A/E,上調(diào)58%(P0.05);P-cofilin/cofilin比例,下調(diào)13%(P0.05);calcinurin A上調(diào)50%(P0.05)。紋狀體中,總drenbrin A/E,上調(diào)45%(P0.05)。伏隔核中,calcinurin A,上調(diào)13%(P0.05)。3.3 M/Lat-A/M與M/M組相比:海馬中,Drebrin與F-actin和G-actin的結合游離比,下調(diào)20%(P0.05);SSH1,下調(diào)64%(P0.01);ARP2,下調(diào)45%(P0.05);P-cofilin/cofilin比例,上調(diào)60%(P0.05);WAVE-2,下調(diào)21%(P0.01)。前額葉皮質(zhì)中,總drenbrin A/E,下調(diào)89%(P0.01);N-WASP,上調(diào)45%(P0.05);WAVE-2,下調(diào)21%(P0.01)。紋狀體中,總drenbrin A/E,下調(diào)56%(P0.01);總cortactin,上調(diào)28%(P0.05);N-WASP,上調(diào)39%(P0.05)。伏隔核中,總cortactin,上調(diào)84%(P0.05);N-WASP,上調(diào)38%(P0.001);WAVE-2,上調(diào)29%(P0.01);calcinurin A,上調(diào)20%(P0.05)。結論:長期嗎啡處理可導致成癮相關腦區(qū)突觸發(fā)生可塑性變化,表現(xiàn)為突觸后膜明顯增厚,并且在戒斷癥狀消失后仍然存在。戒斷完成后再給嗎啡誘導,可以使行為學發(fā)生變化,伴隨肌動蛋白重構,并呈現(xiàn)腦區(qū)特異性。海馬中,肌動蛋白的重構可能與促進蛋白核化和解聚過程有關。第二部分嗎啡誘導條件位置偏愛復燃大鼠海馬肌動蛋白重構及其機制研究目的:研究嗎啡誘導條件位置偏愛復燃大鼠海馬肌動蛋白的變化方法:1嗎啡誘導CPP復燃模型制備:清潔級雄性SD大鼠32只,按隨機分組原則分組,分為N1:NS/NS組,N2:M/NS/M組,N3:M/Lat-A/M組,N4:M/FK-506/M組,每組8只。適應期:1-3天,每天對所有組動物進行CPP監(jiān)測,每次15min,確定動物的偏愛環(huán)境。訓練期:4-11天,N2、N3及N4組動物,每天上午腹腔注射嗎啡10mg/kg,放入伴藥箱中,訓練40 min;下午注射等體積生理鹽水,放入非伴藥箱中,訓練40min。N1組,注射等體積生理鹽水,進行相同訓練。測試期:第12天,所有組動物均進行CPP監(jiān)測。戒斷期:每5天測試一次,約需15天戒斷完成。再誘導期:N1組動物,腹腔注射等體積生理鹽水;N2、N3及N4組動物,雙側(cè)海馬各給以1μL溶劑、0.5μg/μL Latrunculin A及5.0μg/μL FK-506,30min后,腹腔注射10mg/kg嗎啡。所有組動物腹腔注射藥物15min后,進行CPP測試。所有組動物,在所有測試完成后,立馬戊巴比妥鈉麻醉,斷頭取腦,分離相關腦區(qū):海馬(Hip)和伏隔核(NAc)。2 Western-blot檢測腦組織中各種蛋白的表達水平成癮相關腦區(qū)組織勻漿提取總蛋白,測定其中相關蛋白變化。采用不同緩沖液對這兩種蛋白進行分步提取,分別觀察海馬中肌動蛋白(G-actin和F-actin)及其結合蛋白(cofilin,P-cofilin,drebrin A/E,cortactin,N-WASP,Calcinerurin A,Glutamate Receptor 1,P-Glutamate Receptor 1以及β-actin)表達變化。結果:1嗎啡誘導CPP行為評分:在CPP實驗訓練完成24h后,嗎啡組CPP評分與對照組相比,上升400%(p0.05);待大鼠CPP行為完全消退后,再次嗎啡誘導,CPP評分上升1200%(P0.01);與嗎啡誘導組相比,腦室給Latrunculin A和FK-506組CPP評分分別下調(diào)1204%(P0.001)、1260%(P0.001)。2嗎啡誘導CPP復燃大鼠海馬和伏隔核蛋白表達變化2.1 M/NS/M組與NS/NS組相比:海馬中,F-actin/G-actin比例,下調(diào)50%(P0.05);Drebrin A/E與F-actin和G-actin的結合游離比,下調(diào)10%(P0.05);cortactin與F-actin和G-actin的結合游離比,下調(diào)35%(P0.05);P-Glu R1/Glu R1比例,上調(diào)45%(P0.05);Calcineurin A,上調(diào)15%(P0.05)。伏隔核中,P-Glu R1/Glu R1比例,上調(diào)20%(P0.05)。2.2 M/Lat-A/M組與M/NS/M組相比:海馬中,F-actin/G-actin比例,上調(diào)47%(P0.01);cortactin與F-actin和G-actin的結合游離比,上調(diào)35%(P0.05);P-Glu R1/Glu R1比例,下調(diào)65%(P0.01)。伏隔核中,P-Glu R1/Glu R1比例,下調(diào)70%(P0.01)。2.3 M/FK-506/M組與M/NS/M組相比:海馬中,F-actin/G-actin比例,上調(diào)50%(P0.05);Drebrin A/E與F-actin和G-actin的結合游離比,上調(diào)60%(P0.05);cortactin與F-actin和G-actin的結合游離比,上調(diào)50%(P0.05);P-Glu R1/Glu R1比例,下調(diào)60%(P0.05);Calcineurin A,下調(diào)15%(P0.05)。伏隔核中,P-Glu R1/Glu R1比例,下調(diào)50%(P0.01)。結論:嗎啡可誘導大鼠CPP行為消退后復燃,并伴隨海馬肌動蛋白重構;背側(cè)海馬給入Lantruculin A和FK506可抑制嗎啡誘導的大鼠CPP行為復燃,其作用機制可能與抑制海馬肌動蛋白重構,改變海馬投射到伏隔核的谷氨酸能神經(jīng)活性有關。
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R749.6

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 虞冉;葉政;李晶;李敏;白羽;潘群皖;;嗎啡誘導條件性位置偏愛大鼠伏隔核殼區(qū)遙測電活動分析[J];中國應用生理學雜志;2015年01期

2 朱再滿;華田苗;周鴻銘;潘群皖;李晶;李敏;;海洛因誘導CPP大鼠伏隔核腦電活動的無線遙測研究[J];中國應用生理學雜志;2014年04期

3 閆彩珍;于亮;劉川;郝曉玲;王天魁;;嗎啡依賴大鼠不同腦區(qū)肌動蛋白及其結合蛋白的表達變化[J];中國藥理學通報;2011年08期

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本文編號：1249304