本文關(guān)鍵詞：大鼠去細(xì)胞化肝臟生物支架的制備及成分分析

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【摘要】：背景對(duì)于各種肝臟疾病導(dǎo)致的終末期肝衰竭,肝移植是目前醫(yī)學(xué)界公認(rèn)的最具明確療效的治療手段。因目前的供體數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足肝移植的需求,如何解決供肝問題,成為當(dāng)今器官移植領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。去細(xì)胞化肝臟生物支架(Decellularized Liver Bioscaffold,DLB)是目前在組織工程中提出的一個(gè)新觀點(diǎn),通過去細(xì)胞化實(shí)現(xiàn)對(duì)肝臟形態(tài)結(jié)構(gòu)的三維重建,保留原來肝臟的絕大部分細(xì)胞外基質(zhì)成分,包括膠原及彈性纖維等。構(gòu)建一個(gè)理想的DLB,解決傳統(tǒng)生物支架的低免疫原性、仿生性差及機(jī)械強(qiáng)度弱等方面的不足,最終將肝臟細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞等相關(guān)細(xì)胞材料與DLB材料實(shí)現(xiàn)復(fù)合,體外構(gòu)建適合移植的肝臟,實(shí)現(xiàn)對(duì)病態(tài)肝臟的部分或完全替代,將是組織工程及器官移植領(lǐng)域的一個(gè)里程碑。目的本實(shí)驗(yàn)結(jié)合以往去細(xì)胞化器官的制備方案,利用自行設(shè)計(jì)的去細(xì)胞化灌注裝置通過化學(xué)及酶學(xué)相結(jié)合的方法制備大鼠DLB,并在支架制備完成后對(duì)其進(jìn)行成分分析,為下一步進(jìn)行種子細(xì)胞再植構(gòu)建人工肝臟提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。方法1.成年SD大鼠,雌雄不限,10%水合氯醛腹腔注射麻醉。取腹部縱向切口,上至劍突,下至恥骨聯(lián)合上緣,仔細(xì)分離肝臟與周圍組織。于肝下下腔靜脈與右腎靜脈交匯處,行200U/ml肝素鈉溶液全身肝素化處理。顯微操作下門靜脈置入20G留置針,剪開肝上及肝下下腔靜脈,將生理鹽水經(jīng)留置針注入肝臟內(nèi),肝臟顏色逐漸變?yōu)橥咙S色時(shí),停止灌注。仔細(xì)分離肝臟周圍剩余組織,完整取下肝臟。2.將取下的肝臟隨機(jī)分為對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組,對(duì)照組4%甲醛固定留存,實(shí)驗(yàn)組移入去細(xì)胞化裝置中,首先用配制比例為0.02%胰蛋白酶及0.05%EDTA混合溶液灌注2h,其次用配制比例為4%Triton-X 100及0.05%EDTA混合溶液灌注20-24h,然后用1%SDS溶液灌注2h,再用配制比例為0.1%過氧乙酸及4%乙醇混合溶液灌注2h,最后用頭孢唑林鈉溶液灌注肝臟6h以上,DLB制備完成。3.對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組均進(jìn)行固定,常規(guī)行HE染色,透射電鏡掃描,同時(shí)行I型膠原蛋白、CD35、LCA及Vimentin蛋白免疫組化(immunochistochemistry,IHC)分析。結(jié)果1.灌注過程中觀察到大鼠肝臟顏色由土黃色逐漸變?yōu)榘胪该?肝臟的脈管系統(tǒng)逐漸顯現(xiàn)出來。2.HE染色后,對(duì)照組可見大量藍(lán)染并密集分布的細(xì)胞核及粉紅色分布的細(xì)胞外基質(zhì),膠原纖維之間無明顯斷裂。DLB內(nèi)無明顯細(xì)胞核成分殘留,可觀察到呈粉紅色并密集分布的細(xì)胞外基質(zhì)。3.透射電鏡掃描可見對(duì)照組細(xì)胞結(jié)構(gòu)明顯,清晰看到細(xì)胞核卵圓形,高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器較豐富,DLB經(jīng)透射電鏡掃描未見明顯細(xì)胞樣結(jié)構(gòu)殘存,見大量纖維編織成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),排列有序,同時(shí)可見到管狀樣結(jié)構(gòu)等。4.對(duì)照組與DLB內(nèi)的I型膠原蛋白、CD35、LCA及Vimentin蛋白免疫組化OD值結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,CD35、LCA及Vimentin蛋白在對(duì)照組與DLB內(nèi)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,I型膠原蛋白在對(duì)照組與DLB內(nèi)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論利用化學(xué)及酶學(xué)灌注法可以構(gòu)建大鼠DLB,該方案能有效去除肝臟內(nèi)細(xì)胞成分,保留細(xì)胞外基質(zhì),DLB可用于肝臟組織工程的研究。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R657.3

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