本文關(guān)鍵詞：一氧化碳高壓干燥保存對小鼠供心冷缺血再灌注損傷的影響的實(shí)驗(yàn)研究

  更多相關(guān)文章： 一氧化碳 HTK液 冷缺血再灌注損傷 肌鈣蛋白Ⅰ Bcl-2

【摘要】：目的器官移植手術(shù),如腎臟,心臟,肺臟,肝臟的移植,已成為臨床經(jīng)常使用的終末期器官功能衰竭的確實(shí)有效的醫(yī)治手段之一。外科技巧和免疫抑藥物運(yùn)用逐漸成熟,術(shù)后看護(hù)的日益進(jìn)步,使器官移植手術(shù)成功率及預(yù)后不斷提高,但隨之而來的供體器官不足的問題卻日趨凸顯。離體供心無法長期保存已成為限制心臟來源,遏制心臟移植手術(shù)開展的重要瓶頸。如何進(jìn)一步延長供心保存時限,擴(kuò)大供心來源,已經(jīng)成為當(dāng)今世界各國心臟研究中心研究的熱點(diǎn)之一。近幾十年來,研究人員通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)探索過的心臟離體保存法包括簡單低溫保存,低溫高壓氧保存,持續(xù)灌注保存,間歇灌注保存及深低溫保存等[1]。上訴各保存方法均能在一定程度上延長供心保存時間,它們在保存過程中,均需將心臟浸泡保存于心臟停跳液中,利用心臟停跳液作為心臟體外保存的媒介。但在離體供心保存時,由于缺血缺氧環(huán)境,ATP生成障礙,導(dǎo)致心肌細(xì)胞膜上鈉鉀泵失活,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外滲透壓發(fā)生改變,導(dǎo)致心肌纖維產(chǎn)生水腫及不可逆的損傷,故心臟的離體保存時間尚未能取得突破性的進(jìn)展。雖然,通過改良保存液的方式,如往保存液中添加葡萄糖、谷氨酸、抗氧化劑及鈣離子通道拮抗劑等,能部分減少保存過程中的不良影響,但其效果并不理想。當(dāng)前,公認(rèn)的心臟有效保存時間僅為4h-6h[2]。一氧化碳(Carbon monoxide, CO)是一種無色無味的惰性氣體,研究發(fā)現(xiàn)C0具有第二信使的作用,是一種重要的信號分子,在全身多個器官系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。大量研究表明C0可作為一種新的抗凋亡氣體運(yùn)用于器官移植領(lǐng)域,多個體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)將C0運(yùn)用于大鼠的心,肺,肝,腎,小腸,腎臟等器官,在減輕器官缺血再灌注損傷(Ischemia-reperfusion injury, IRI)方面均取得了良好的效果。目前,國內(nèi)針對C0對供體心臟保護(hù)作用的研究大都采用化學(xué)藥物體內(nèi)誘導(dǎo)的方法,常見的有利用二氯甲烷(Methylene chloride, MC)等誘導(dǎo)劑喂食小鼠,促進(jìn)小鼠體內(nèi)內(nèi)源性的CO氣體生成,可將供心保存時間延長至8-10h。若利用CO的生物學(xué)特性,通過改良供心保存方法,建立一種有效心臟長期保存方法,將大大的提高心臟移植手術(shù)的成功率及預(yù)后,為廣大終末期心臟病患者帶來新的希望。本課題選用一氧化碳高壓干燥保存這一嶄新的心臟保存方式來保存小鼠離體心臟,以探討這一方法對小鼠供心冷缺血再灌注損傷的保護(hù)作用效果,并研究其相關(guān)作用機(jī)制。方法選取健康雄性C57BL/6小鼠,通過建立同系小鼠心臟頸部異位移植模型來觀察供心移植后改變。供體鼠選用4-6W C57BL/6小鼠48只,隨機(jī)分為4組(n=12),即A組：空白對照組,B組：即刻移植組,C組：HTK保存組,D組：CO高壓干燥保存組；受體鼠選用8-10w C57BL/6小鼠36只,隨機(jī)分為3組(n=12),分別作為即刻移植組、HTK保存組,CO高壓干燥保存組的受體。供體小鼠處理：4～6w供體組小鼠,麻醉成功后,剪開腹壁,充分暴露下腔靜脈,經(jīng)下腔靜脈注射4℃肝素水1ml (100u/ml)。剪開胸壁及膈肌暴露心臟,經(jīng)下腔靜脈向心臟緩慢注射高鉀停搏液,直至心臟停跳。分離并將心肺聯(lián)合取下。將分離后心肺組織快速放置于盛有4℃冰凍肝素生理鹽水的培養(yǎng)皿中。供心處理：顯微鏡下修整供心,除肺動脈及主動脈外,余各個心臟血管均予結(jié)扎。用彎頭顯微鑷經(jīng)左右心耳小切口進(jìn)入左右心房腔,鈍性分離房間隔,聯(lián)通左右心房。經(jīng)主動脈殘端置管,緩慢逆行灌注保存液(根據(jù)分組不同,空白對照組、即刻移植組、HTK保存組三組供心灌注HTK液,CO高壓干燥保存組供心灌注改良KH液)灌注壓力固定為30cmH2O,灌注時間約為2～3min。空白對照組供心處理完后馬上取材行相關(guān)檢查；即刻移植組供心處理完后馬上行異位移植手術(shù)移植；HTK保存組供心處理完后置于15ml 4℃HTK液中保存24h；CO高壓干燥保存組供心處理完成后,主動脈殘端留置一灌注管,使主動脈開口處于開放狀態(tài),且冠脈內(nèi)及主動脈殘端留置的灌注管內(nèi)均充滿改良KH液,經(jīng)此處理后供心懸掛于高壓氣體罐中保存(PO2:3.2×101.325 kPa+PCO:0.8×101.325 kPa=4× 101.325 kPa),并將高壓罐放入4℃冰箱24h,注意留意高壓罐的氣壓改變并及時補(bǔ)充不足的氣體。建立同系小鼠心臟頸部異位移植模型：8～10w小鼠作為受體鼠,麻醉滿意之后,沿小鼠右鎖骨中點(diǎn)至右側(cè)頜下縱行剪開頸部皮膚,充分顯露并分離右頸內(nèi)靜脈及頸總動脈,于頸動靜脈遠(yuǎn)端結(jié)扎,近端予顯微血管夾夾閉。采用改良cuff方法,將靜脈殘端穿入靜脈套管后外翻,呈袖套樣套于靜脈套管壁上,并予10-0絲線固定。肝素生理鹽水沖洗靜脈腔,將靜脈腔內(nèi)殘留組織碎片及血栓祛除。同理處理頸總動脈。受體小鼠準(zhǔn)備完畢之后,取出經(jīng)不同保存條件處理后的供心,將其置于含4℃冰生理鹽水的培養(yǎng)皿中進(jìn)行修整。生理鹽水沖洗并排出左右心耳、主動脈及肺動脈內(nèi)氣體,結(jié)扎左右心耳切口,取出主動脈殘端留置的灌注管,修剪主動脈及肺動脈于合適長度。顯微鏡下,將受體鼠帶套管的頸總動脈套于供心主動脈內(nèi),頸內(nèi)靜脈套于肺動脈內(nèi),并將主動脈壁及肺動脈壁分別結(jié)扎固定于套管壁上。手術(shù)完畢后,先開放頸靜脈的近心端,再開放頸動脈的進(jìn)心端,開放后觀察供心表面及吻合口是否有滲血及梗阻的情況,并予相應(yīng)處理。開放后觀察供心2h,記錄心臟的復(fù)跳情況、質(zhì)地改變及顏色變化。根據(jù)供心開放后供心搏動情況,記錄供心復(fù)跳率；根據(jù)供心復(fù)灌后收縮強(qiáng)度、顏色及心肌硬度行移植物活力評分,最低0分,滿分5分,分?jǐn)?shù)越高代表心肌活力越好,術(shù)后供心存活時間越長。觀察完畢后,縫皮,受體鼠保溫、獨(dú)籠飼養(yǎng)。術(shù)后供心取樣檢測：除空白對照組小鼠供心處理后即刻取樣檢測外,余三組供心均于移植后24h取樣行相關(guān)檢測。移植后24h,處死受體小鼠,抽血后分離提取血清,檢測血清肌鈣蛋白I(Troponin I, TnI)濃度變化；取供心心肌組織,采用蘇木精—伊紅(hematoxylin-eosinstaining, HE)染色法對組織切片進(jìn)行染色,對比四組供心心肌細(xì)胞排列、細(xì)胞間質(zhì)水腫程度、冠脈血管周圍組織改變及炎癥細(xì)胞浸潤程度,缺口末端標(biāo)記法(terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL)檢測凋亡染色陽性心肌細(xì)胞,并于高倍鏡下行凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù),計(jì)算凋亡指數(shù),比較各組心肌細(xì)胞凋亡程度,采用行蛋白免疫印跡法(Western-blot, WB)檢測B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma 2, Bcl-2)的蛋白表達(dá)水平,從而推斷細(xì)胞凋亡改變的可能原因。結(jié)果建模成功2h后,于手術(shù)顯微鏡下可見：即刻移植組供心顏色紅潤,搏動強(qiáng),竇性心律,心室壁柔軟富有彈性,冠脈通暢,未見明顯出血、淤血表現(xiàn)。HTK保存組心臟組織顏色多呈黑紅色、彈性差,心室壁僵硬,多為無搏動或局部心房搏動,心律失常多見,冠脈內(nèi)血流淤滯,冠脈周圍可見彌漫性出血灶,供心多于移植后24h內(nèi)停止搏動。CO高壓干燥保存組：心臟顏色紅稍偏暗,彈性稍差,心室壁稍顯僵硬,搏動多為竇性心律,心肌收縮力較即刻移植組減弱,冠脈內(nèi)血流通暢,冠脈周圍可見少量散在出血點(diǎn)。移植物活力評分結(jié)果：各組移植物活力評分分別用中位數(shù)、第1四分位數(shù)(P25%)及第3四分位數(shù)(P75%)表示,即刻移植組、HTK保存組及CO高壓干燥保存組活力評分分?jǐn)?shù)為5(5-5)、0(0-1)、3(2.25～3.75),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。調(diào)整檢驗(yàn)水平α’=α/3=0.0167,行兩兩比較后發(fā)現(xiàn),即刻移植組活力評分高于HTK保存組及CO高壓干燥保存組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01),CO高壓干燥保存組評分高于HTK保存組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01)各組供心復(fù)跳率結(jié)果為：即刻移植組中有10只、HTK保存組中有2只、CO高壓干燥保存組中有9只供心移植后復(fù)跳(n=12),復(fù)跳率分別為83.3%、16.7%、75.0%。三組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(z2=13.03,P=0.00150.01)。調(diào)整檢驗(yàn)水準(zhǔn)α'=α/3=0.0167后,行多樣本兩兩比較,CO高壓干燥保存組的復(fù)跳率與即刻移植組的復(fù)跳率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=10.0167),但明顯高于HTK保存組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.0167)。HTK組復(fù)跳率明顯低于即刻移植組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(X2=10.67, P=0.00110.01)。四組血清肌鈣蛋白I濃度分別為：空白對照組：(0.28±0.02)ng/m1,即刻移植組：(0.37±0.03)ng/ml,HTK保存組：(2.02±0.05)ng/ml,CO高壓干燥保存組：(1.59±0.04)ng/ml。組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6404.74,P0.01),即刻移植組較空白對照組稍升高(P0.001)；CO高壓干燥保存組明顯高于即刻移植組(P0.001),但低于HTK保存組(P0.001),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。四組供心的HE染色對比發(fā)現(xiàn),光學(xué)顯微鏡下,空白對照組供心組心肌細(xì)胞染色均一,排列致密,細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整清晰,間質(zhì)未見水腫,冠脈壁完整,周圍未見明顯紅細(xì)胞滲出；即刻移植組供心心肌組織染色均一,細(xì)胞排列有序,細(xì)胞結(jié)構(gòu)完成,組織間質(zhì)稍水腫；HTK保存組供心,可見部分心肌細(xì)胞變性,細(xì)胞排列紊亂,細(xì)胞間可見核深染中性粒細(xì)胞浸潤,心肌細(xì)胞間質(zhì)可見紅細(xì)胞滲出；CO高壓干燥保存組：供心心肌細(xì)胞排列致密,結(jié)構(gòu)完整,排列基本規(guī)整,染色較均勻,心肌細(xì)胞較完整,心肌細(xì)胞間質(zhì)可見少量中性粒細(xì)胞侵潤,未見明顯紅細(xì)胞滲出。Tunel檢測顯示,空白對照組心肌細(xì)胞呈均一的淡染,未見異常核。即刻移植組心肌細(xì)胞染色均勻,偶見綠色陽性細(xì)胞,HTK保存組可見大量綠色陽性凋亡細(xì)胞, CO高壓干燥保存組可見少量綠色陽性凋亡細(xì)胞,但明顯少于HTK保存組�？瞻讓φ战M、即刻移植組、HTK保存組及CO高壓干燥保存組凋亡細(xì)胞指數(shù)分別1.08±0.15、3.96±0.41、15.83±1.33、4.21±0.28,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1003.67,P0.01)。空白對照組凋亡指數(shù)遠(yuǎn)小于其余三組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。即刻移植組凋亡指數(shù)小于HTK保存組(P0.01),但與CO高壓干燥保存組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.440.05)。CO高壓干燥保存組較HTK保存組的凋亡指數(shù)明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。Western-blot檢測發(fā)現(xiàn)：空白對照組、即刻移植組、HTK保存組、CO高壓干燥保存組的Bcl-2蛋白表達(dá)量分別為(0.14±0.01)、(0.18±0.01)、(0.62±0.05)、(0.71±0.05),組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=750.79,P0.01)。多樣本間兩兩比較后發(fā)現(xiàn),空白對照組Bcl-2蛋白表達(dá)量最低,即刻移植組心肌Bcl-2表達(dá)低于HTK保存組(P0.01)及CO高壓干燥保存組(P0.01),CO高壓干燥保存組的心肌細(xì)胞Bcl-2蛋白高于HTK保存組(P=0.0030.01),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論CO高壓干燥保存是一種有效的心臟保存方法。該方法可有效延長小鼠供心離體保存時間,減少離體供心冷缺血再灌注損傷,提高移植后供心復(fù)跳率。但是,其在供心保存過程中的具體作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究證實(shí)。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R654.2

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 王成懷;微生物的保存方法(續(xù)五)[J];微生物學(xué)免疫學(xué)譯刊;1981年01期

2 葉桔泉;貯存和食用花粉應(yīng)注意的問題[J];食品科技;1983年07期

3 王波;周正;徐夢潔;許先國;張紹志;陳光明;;擱板溫度對人血小板凍干保存的影響[J];上海理工大學(xué)學(xué)報;2013年02期

4 帖彪,陳鵬,袁軍,劉祖國;長期干燥保存角膜表面鏡片應(yīng)用一例[J];眼外傷職業(yè)眼病雜志.附眼科手術(shù);2002年06期

5 張廷鉞;馬吉獻(xiàn);于純智;;干燥保存角膜的實(shí)驗(yàn)研究與臨床應(yīng)用[J];眼科;1995年01期

6 段亞東,楊寧江,黃晶波,劉大力;干燥保存結(jié)膜的臨床移植研究[J];空軍醫(yī)高專學(xué)報;1999年02期

7 ;動態(tài)與簡訊[J];國外醫(yī)學(xué)(衛(wèi)生學(xué)分冊);1981年03期

8 段亞東，，楊寧江;干燥保存結(jié)膜移植的應(yīng)用研究[J];眼科新進(jìn)展;1996年02期

9 蘭芬;;抗衰強(qiáng)體何首烏[J];長壽;2007年12期

10 ;[J];;年期

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 何德功;日本開發(fā)出移植心臟干燥保存技術(shù)[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報;2005年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 黃帥;一氧化碳高壓干燥保存對小鼠供心冷缺血再灌注損傷的影響的實(shí)驗(yàn)研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2015年

2 楊維;皮膚組織干燥保存的研究[D];西北大學(xué);2009年

3 騰飛;二氧化碳氧氣混合氣干燥保存周圍神經(jīng)的實(shí)驗(yàn)研究[D];復(fù)旦大學(xué);2010年

本文編號：1239724