本文關(guān)鍵詞：血管內(nèi)皮祖細(xì)胞逆轉(zhuǎn)骨質(zhì)疏松大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性的研究

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【摘要】：研究背景:絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松(postmenopausal osteoporosis,PMOP)是由于女性絕經(jīng)后雌激素合成和分泌不足致使骨形成和骨吸收代謝失衡,骨丟失,骨密度降低造成的一種常見(jiàn)的全身性疾病。研究證實(shí)雌激素水平降低是造成PMOP的重要原因,導(dǎo)致牙槽骨吸收加快,牙齒缺失,牙周組織的再生與修復(fù)困難。近年來(lái)隨著骨組織工程的深入研究,應(yīng)用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)修復(fù)頜骨、牙槽骨缺損取得了較大進(jìn)展。然而,國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn),雌激素缺乏的微環(huán)境會(huì)導(dǎo)致BMSCs凋亡增加以及骨向分化能力降低,此時(shí)依靠單純BMSCs植入來(lái)修復(fù)骨缺損,由于缺乏必要的營(yíng)養(yǎng)支持和適宜的局部微環(huán)境,從而導(dǎo)致其生存能力降低。綜上,應(yīng)用干細(xì)胞移植方法來(lái)修復(fù)骨缺損能夠成功的關(guān)鍵是提高移植物中BMSCs的存活率并保持其干細(xì)胞的特性。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)EPCs具有特異性歸巢的能力,能通過(guò)自身的分化、增殖形成新生血管,對(duì)改善微環(huán)境具有獨(dú)特的優(yōu)越性。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)建立血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)與去勢(shì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(OVX-BMSCs)transwell間接共培養(yǎng)體系,來(lái)探明EPCs是否能夠逆轉(zhuǎn)OVX-BMSCs的生物學(xué)特性,以奠定臨床骨質(zhì)疏松患者牙槽骨修復(fù)的理論基礎(chǔ)。研究目的:本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用大鼠血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)與去勢(shì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(OVX-BMSCs)進(jìn)行體外transwell間接共培養(yǎng),觀察EPCs對(duì)OVX-BMSCs增殖、凋亡及分化特性的影響,為臨床修復(fù)骨質(zhì)疏松患者的牙槽骨缺損提供理論依據(jù)。研究?jī)?nèi)容:(1)去勢(shì)大鼠骨質(zhì)疏松模型的建立。(2)假手術(shù)組和去勢(shì)組大鼠BMSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定;假手術(shù)組大鼠EPCs的分離、培養(yǎng)及鑒定。(3)在transwell間接共培養(yǎng)條件下,研究EPCs對(duì)OVX-BMSCs增殖、凋亡及分化能力的影響。研究方法:(1)建立去勢(shì)大鼠骨質(zhì)疏松模型:造模的方法是選擇適合月齡(3月齡)的雌性大鼠,用10%水合氯醛經(jīng)腹腔注射麻醉,選用背部雙側(cè)切口,鈍性分離進(jìn)腹腔,沿輸卵管逆行確定卵巢位置后絲線結(jié)扎將其切除,結(jié)扎殘端、依次縫合切口。假手術(shù)組僅切除卵巢周?chē)攘康闹窘M織。術(shù)后3個(gè)月,采用micro-CT掃描股骨對(duì)大鼠模型進(jìn)行評(píng)估。(2)EPCs的分離培養(yǎng):本實(shí)驗(yàn)利用percoll淋巴細(xì)胞分離液經(jīng)密度梯度離心獲取假手術(shù)組大鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞,通過(guò)差速貼壁結(jié)合特殊內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基擴(kuò)增來(lái)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的分化,通過(guò)倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài),雙熒光免疫染色法檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞功能,應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分子表型鑒定。(3)BMSCs的分離培養(yǎng):本實(shí)驗(yàn)采用密度梯度離心法結(jié)合貼壁法來(lái)分離培養(yǎng)去勢(shì)組和假手術(shù)組大鼠BMSCs;于倒置相差顯微鏡下觀察BMSCs細(xì)胞形態(tài),應(yīng)用流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)分子表型,進(jìn)行成骨成脂誘導(dǎo)進(jìn)一步鑒定其干性。(4)建立EPCs和OVX-BMSCs間接共培養(yǎng)體系并進(jìn)行相關(guān)檢測(cè):實(shí)驗(yàn)組為EPCs和OVX-BMSCs以相同的密度分別接種于transwell底膜和6孔板底,并設(shè)置單純?nèi)?shì)組BMSCs和單純假手術(shù)組BMSCs接種作為2組對(duì)照組。間接共培養(yǎng)條件下,利用流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組BMSCs的增殖能力和凋亡率;ALP染色、茜素紅染色觀察三組BMSCs礦化結(jié)節(jié)的形成,Real-time PCR方法檢測(cè)三組BMSCs成骨基因的表達(dá)情況;油紅O染色觀察三組BMSCs脂滴形成情況,Real-time PCR方法檢測(cè)三組BMSCs成脂基因的表達(dá)。研究結(jié)果:(1)去勢(shì)大鼠手術(shù)三個(gè)月后,micro-CT掃描結(jié)果顯示去勢(shì)組骨小梁排列明顯較假手術(shù)組稀疏,骨小梁密度減小,間隙增加。分析兩組大鼠骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)及骨表面積和骨體積比(BS/BV)顯示去勢(shì)組和假手術(shù)組相比兩者有顯著性差異(P0.01),由此可證明本實(shí)驗(yàn)中SD雌性大鼠去卵巢骨質(zhì)疏松模型造模成功。(2)本實(shí)驗(yàn)中采用密度梯度離心法結(jié)合差速貼壁法,利用內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)EPCs的生長(zhǎng),通過(guò)倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài),呈典型的“鋪路石”狀,應(yīng)用流式細(xì)胞儀技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞表型鑒定,結(jié)果顯示細(xì)胞高表達(dá)造血干細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物,細(xì)胞雙熒光染色陽(yáng)性,表明培養(yǎng)細(xì)胞為EPCs。(3)本實(shí)驗(yàn)中采用密度梯度離心法結(jié)合貼壁法分離培養(yǎng)BMSCs,倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)呈長(zhǎng)梭型,誘導(dǎo)細(xì)胞成骨、成脂分化,并且通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表型,結(jié)果表明培養(yǎng)的細(xì)胞高表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記,幾乎不表達(dá)造血干細(xì)胞表面標(biāo)記,表明培養(yǎng)的細(xì)胞為BMSCs。(4)在間接共培養(yǎng)條件下,應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)三組BMSCs的增殖能力和凋亡率,結(jié)果顯示EPCs與OVX-BMSCs間接共培養(yǎng)組的S期細(xì)胞數(shù)顯著大于去勢(shì)組BMSCs S期細(xì)胞數(shù),且大于假手術(shù)組BMSCs S期細(xì)胞數(shù)(P0.05);共培養(yǎng)組OVX-BMSCs細(xì)胞凋亡率顯著小于去勢(shì)組BMSCs凋亡率,且小于假手術(shù)組BMSCs凋亡率(P0.05)。ALP染色和茜素紅染色結(jié)果顯示共培養(yǎng)組OVX-BMSCs的礦化結(jié)節(jié)形成多于去勢(shì)組和假手術(shù)組,Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示共培養(yǎng)組OVX-BMSCs成骨基因Runx2、OCN、BSP的表達(dá)水平比去勢(shì)組BMSCs明顯上調(diào),跟假手術(shù)組BMSCs相比也明顯上調(diào)(P0.05)。油紅O染色結(jié)果顯示共培養(yǎng)組OVX-BMSCs的脂滴形成多于去勢(shì)組和假手術(shù)組,Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示共培養(yǎng)組OVX-BMSCs成脂基因LPL、PPARγ2的表達(dá)水平比去勢(shì)組BMSCs明顯上調(diào),跟假手術(shù)組BMSCs相比也明顯上調(diào)(P0.05)。結(jié)論:(1)選用3月齡SD雌性大鼠行雙側(cè)卵巢摘除,術(shù)后3個(gè)月micro-CT掃描結(jié)果及相關(guān)分析顯示成功建立去勢(shì)大鼠骨質(zhì)疏松模型。(2)間接共培養(yǎng)條件下,EPCs可逆轉(zhuǎn)OVX-BMSCs的增殖能力,降低其凋亡率。(3)間接共培養(yǎng)條件下,EPCs可逆轉(zhuǎn)OVX-BMSCs的成骨分化能力,增強(qiáng)其成脂分化能力。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R580
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本文編號(hào)：1146976