本文關(guān)鍵詞：結(jié)直腸腫瘤脂肪酸吸收差異及其在共聚焦內(nèi)鏡中的診斷應(yīng)用

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【摘要】：研究背景惡性腫瘤代謝改變逐漸被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中關(guān)鍵因素,早在1920年,德國生物化學(xué)家Otto Warburg就發(fā)現(xiàn)了腫瘤細(xì)胞代謝的特點(diǎn),即高水平的糖酵解作用,并據(jù)此拿下了諾貝爾獎。腫瘤細(xì)胞用有氧糖酵解替代正常組織細(xì)胞的氧化磷酸化,這些不能經(jīng)由線粒體途徑獲得ATP的腫瘤細(xì)胞,只能進(jìn)行代謝重組,以維持細(xì)胞內(nèi)的ATP和NADH水平正常,進(jìn)行“低效但快速”的能量供給以支持自身的生存,增殖以及轉(zhuǎn)移。此效應(yīng)現(xiàn)已得到深入研究,且這種代謝差異已應(yīng)用于PET-CT顯像中。18F-氟代脫氧葡萄糖(18F-2-fluro-D-deoxy-glucose, 18F-FDG,)是葡萄糖的類似物,其進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)形成6-P-18FDG,6-P-18FDG不能被進(jìn)一步分解,而滯留堆積在細(xì)胞內(nèi),故細(xì)胞對18F-FDG的攝取量與其葡萄糖代謝率成正比。PET-CT利用18F-FDG作為葡萄糖代謝示蹤劑,因惡性腫瘤部位18F-FDG聚集異常增加,從而通過病灶對顯像劑的攝取來反映其代謝變化,為臨床提供疾病的生物代謝信息。除了有氧糖酵解之外,腫瘤細(xì)胞另一個(gè)重要的代謝特征即為脂肪酸合成(lipogenesis)的增加,腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展均與自身細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的從頭合成相關(guān)。正常情況下,細(xì)胞主要從胞外攝取脂肪酸并將其轉(zhuǎn)化為甘油三酯,以提供機(jī)體的能量儲備。然而在腫瘤細(xì)胞中,盡管外源性的脂肪酸供給充足,腫瘤細(xì)胞極少利用其進(jìn)行甘油三酯的儲備,而主要依靠糖酵解產(chǎn)物丙酮酸進(jìn)行內(nèi)源性的脂肪酸合成,不同類型的腫瘤細(xì)胞可自身合成多達(dá)95%的飽和或單不飽和脂肪酸。但是相較于糖代謝,對惡性腫瘤細(xì)胞脂肪代謝的研究尚未深入。結(jié)腸癌作為全球常見惡性腫瘤之一,每年近100萬人被診斷為新發(fā)病例,其中一半將死于結(jié)腸癌。結(jié)腸癌成為了全球第四致死性惡性腫瘤。大部分散發(fā)的結(jié)直腸癌經(jīng)腺瘤癌變而來,據(jù)統(tǒng)計(jì),95%的結(jié)直腸癌患者將獲益于疾病的早期診斷。結(jié)直腸癌的早期診斷大致可分為兩類,其一是非侵入性的檢查,例如血常規(guī),血清腫瘤標(biāo)記物,糞便常規(guī),影像學(xué)等檢查手段等；另一類便是內(nèi)鏡檢查,內(nèi)鏡現(xiàn)已被認(rèn)為是結(jié)直腸癌早期篩查最有效的方式,新興的內(nèi)鏡如染色內(nèi)鏡、放大內(nèi)鏡、超聲內(nèi)鏡等明顯提高了早期胃腸道腫瘤的檢出率。在內(nèi)鏡技術(shù)迅猛發(fā)展的現(xiàn)在,內(nèi)鏡檢查過程中能夠?qū)ο鲤つげ∽冞M(jìn)行實(shí)時(shí)、動態(tài)組織學(xué)預(yù)測成為了目前內(nèi)鏡發(fā)展的主要方向,而共聚焦內(nèi)鏡也應(yīng)運(yùn)而生。它是一種將微型共聚焦顯微鏡整合于傳統(tǒng)內(nèi)鏡前端的新興技術(shù),通過點(diǎn)掃描激光分析,可在內(nèi)鏡檢查的同時(shí)獲取高分辨的黏膜表面和粘膜細(xì)胞形態(tài)學(xué)圖像,可將掃描檢查的組織放大1000倍,可對活體細(xì)胞和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察,為體內(nèi)組織學(xué)研究提供快速,可靠的診斷方法和診斷價(jià)值。BODIOY-FA(購買于life科技有限公司,貨號：D3823,全稱BODIPY(?)500/510C1,C12(4,4-Difluoro-5-Methyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-DodecanoicAcid))其分子量為404,是熒光標(biāo)記的長鏈脂肪酸類似物,具有親脂性,其已被廣泛應(yīng)用于脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的研究中,其激發(fā)／發(fā)射波長為500/510nm,能被488nm的氬離子激光器激活,可用于流式細(xì)胞儀及共聚焦顯微鏡下觀察。在前期研究中,我們對95例腸癌組織及其對應(yīng)正常組織的蛋白表達(dá)譜進(jìn)行了匯總分析(取自于腫瘤基因圖譜(The Cancer Genome Atlas)公開數(shù)據(jù)),根據(jù)分析數(shù)據(jù)繪制了相應(yīng)代謝通路,我們發(fā)現(xiàn),相較于正常細(xì)胞,癌細(xì)胞的代謝差異具體表現(xiàn)為：(1)癌細(xì)胞有氧糖酵解及胞內(nèi)脂肪酸合成(其終產(chǎn)物為飽和脂肪酸)相關(guān)酶類大部分表達(dá)顯著升高；(2)胞內(nèi)脂肪酸利用(轉(zhuǎn)化為膽固醇、磷脂、甘油三酯及非飽和脂肪酸類)相關(guān)酶類表達(dá)減少；(3)胞內(nèi)脂肪酸氧化相關(guān)酶類表達(dá)減少；(4)細(xì)胞膜上脂肪酸相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)減少；基于此,我們提出如下猜想：腫瘤的代謝網(wǎng)運(yùn)用自身的可塑性,反饋循環(huán)以及相互作用以維持一個(gè)適宜的腫瘤環(huán)境,其中可塑性是其最重要的特性。有氧糖酵解及脂肪酸合成的增加以及胞內(nèi)脂肪酸的轉(zhuǎn)化和利用的減少,都將導(dǎo)致胞內(nèi)脂肪酸(飽和脂肪酸)的蓄積,而胞內(nèi)脂肪酸的蓄積將會導(dǎo)致產(chǎn)生脂毒性及活性氧類物質(zhì)的增加,因此,腫瘤細(xì)胞通過增加NAPDH的生成以對抗應(yīng)激及維持細(xì)胞生長,同時(shí),脂肪酸合成增加可使胞內(nèi)的飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸含量增加以增加膜的密度,而細(xì)胞膜密度的增加也可阻礙外源性脂肪酸進(jìn)入腫瘤細(xì)胞；此外,我們還發(fā)現(xiàn)了胞膜上的脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)的降低,綜上所述,是否代表腫瘤細(xì)胞可通過改變其脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)而使攝取外來脂肪酸呢?帶著這樣的疑問,我開始著手對課題的研究。研究目的探討大腸腫瘤中脂肪酸吸收減少的現(xiàn)象和相關(guān)機(jī)制,并將共聚焦內(nèi)鏡作為載體,進(jìn)一步拓展脂肪酸代謝的臨床應(yīng)用價(jià)值。研究方法1、Q-PCR, Western-Blot,免疫組化檢測人腸道腺瘤組織,大腸癌組織與相應(yīng)的正常組織脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)差異(1)熒光定量PCR：提取組織總RNA并檢測濃度,根據(jù)Takara PrimeScript RT Master Mix Perfect Real Time RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒完成cDNA合成,使用TaKaRa SYBR Premix Ex Taq試劑盒和LC480 System熒光定量PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行熒光定量PCR檢測。(2) Western-Blot:提取組織蛋白,用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒檢測樣品的蛋白濃度。經(jīng)電泳、切膠,電轉(zhuǎn)過程,蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至PVDF膜,5%BSA封閉,一抗孵育4℃過夜,一抗稀釋比例分別為CD36(1:200)、FABP1(1:500)、Caveolin-1(1：500)、GAPDH (1:2000), TBST洗膜,而后二抗(1：2000)孵育1小時(shí),按1：1比例配制Millipore Immobilon Western化學(xué)發(fā)光HRP底物試劑預(yù)混液化學(xué)發(fā)光法顯影。(3)免疫組化：腸道增生性息肉(10例),低級別上皮內(nèi)瘤變(10例),高級別上皮內(nèi)瘤變(10例),以及結(jié)直腸癌手術(shù)患者配對標(biāo)本(配對20例),組織經(jīng)常規(guī)固定、包埋、切片、脫蠟、水化后,用0.01M枸櫞酸鈉緩沖液(pH6.0)高壓抗原修復(fù)3分鐘,開蓋自然冷卻至室溫,用Thermo scientific公司UltraVision Quanto Detection System HRP DAB二步法抗兔抗鼠通用性免疫組織化學(xué)檢測試劑盒阻斷、封閉,一抗稀釋濃度為CD36(1：200)、FABP1(1:250)、 Caveolin-1(1：250),一抗孵育4℃冰箱過夜,然后DAB顯色,蘇木素復(fù)染、返藍(lán),常規(guī)脫水、透明及封片后,于顯微鏡下觀察。2、流式細(xì)胞儀及共聚焦顯微鏡檢測BODIPY-FA的吸收與定位(1)將細(xì)胞以相同密度5×106個(gè)/孔培養(yǎng)于用鋁箔覆蓋的十二孔板中,分別加入1ml含10% FBS的DMEM,溫箱培養(yǎng)過夜。吸去培養(yǎng)基并用PBS清洗2次后,分別加入預(yù)溫的1ml的2μmol BODIPY-FA混合液(溶于二甲亞砜(DMSO)保存,后根據(jù)所需濃度加入1 xPBS和0.1%牛血清蛋白(BSA)配成工作液),于恒溫箱內(nèi)放置3分鐘,5分鐘,10分鐘,15分鐘4個(gè)時(shí)間點(diǎn),后吸去BODIPY-FA,PBS清洗并放入0℃冰上終止反應(yīng),經(jīng)消化、離心后,流式細(xì)胞儀檢測各時(shí)間點(diǎn)不同細(xì)胞對BODIPY-FA的熒光吸收值。(2)收集3例新鮮的腸癌組織及其對應(yīng)的正常粘膜,將組織碎塊放入培養(yǎng)皿中,置于冰上,反復(fù)洗滌,將組織碎塊剪碎碾磨并放入離心管中,管內(nèi)加入10ml溶于HBSS的50mg/ml IV型膠原酶,10 mg/ml鏈霉素E,2000U/ml脫氧核糖核酸酶及0.1mmol/L EDTA,37℃恒溫箱并不斷搖晃,后用100μm細(xì)胞過濾器去除未溶解組織碎片。然后用不含鈣鎂的HBSS溶液清洗細(xì)胞,1000rpm離心2-3min,重復(fù)2次。離心去上清,用HBSS重懸,過濾至新的無菌離心管中,加入等量的分離液,600g離心20min收集中間層,加入HBSS,重復(fù)上述清洗步驟,后加入預(yù)熱的1ml的2μmol/LBODIPY-FA混合液,恒溫箱內(nèi)放置1分鐘、5分鐘、15分鐘3個(gè)時(shí)間點(diǎn),后續(xù)實(shí)驗(yàn)步驟同前。(3)將細(xì)胞鋪種于激光共聚焦專用培養(yǎng)皿,加入1ml含10%胎牛血清(FBS)的高糖培養(yǎng)基(DMEM)中,放入含5%C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24h。待細(xì)胞在細(xì)胞爬片上貼壁并且充分伸展開后,去除培養(yǎng)基,加入1ml PBS緩沖液清洗三次；后加入1ml 2μmol BODIPY-FA混合液孵育細(xì)胞15min(置于恒溫箱中),PBS清洗細(xì)胞三遍,然后用1ml 4%多聚甲醛固定細(xì)胞30min,后滴加DAPI(1：20000)避光孵育15min,使細(xì)胞核染色。用Olympus激光共聚焦顯微鏡FV1000進(jìn)行拍照。3、人離體組織的獲取、成像及分類(1)人離體新鮮組織標(biāo)本的收集來源于南方醫(yī)院普外科及消化內(nèi)科,病人篩選基于以下原則：①可獲得病人完整的臨床病理及隨訪資料；②病人術(shù)前無進(jìn)食大量的高脂肪食物或服用脂類藥物。此項(xiàng)研究獲得南方醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(NFEC-2015-083)。(2)離體新鮮組織熒光顯微鏡成像：前期實(shí)驗(yàn)證實(shí),小鼠離體大腸組織20分鐘內(nèi)仍可保持其吸收活性并呈現(xiàn)出良好的成像效果,為了盡量模擬在體成像,實(shí)驗(yàn)中將外科手術(shù)獲取的新鮮的腸癌與正常交界部位組織立即放入37℃,5m1250μmol/L避光的BODIPY-FA混合液中浸染5min,后用預(yù)冷的生理鹽水沖洗3遍并將其表面的水分擦干,將組織即刻包埋于OCT中,于干冰中速凍,后將組織置于冰凍切片機(jī)中(溫度保持于-20℃)進(jìn)行快速冰凍切片,厚度為4um,輪流貼片,同一部位對應(yīng)兩塊玻片,其一行HE染色用于普通白光顯微鏡觀察,經(jīng)蘇木素染色、分化、返藍(lán)、伊紅染色、梯度脫水后,用中性樹膠封片；對應(yīng)的另一塊組織玻片用DAPI染核,PBST清洗風(fēng)干后(避光),用抗熒光猝滅封片劑封片,然后再進(jìn)行熒光顯微鏡觀察。(3)離體新鮮組織共聚焦成像：將內(nèi)鏡切除的腸道組織標(biāo)本及手術(shù)獲取的新鮮腸癌組織與其對應(yīng)的正常組織立即放入5m1250μmol/L的BODIPY-FA混合液中浸染15min,后用后用預(yù)冷的生理鹽水沖洗以清除未結(jié)合的BODIPY-FA,成像過程由消化科內(nèi)鏡醫(yī)師執(zhí)行：即將共聚焦內(nèi)鏡的激光探頭輕放置組織粘膜的表面,并由淺及深依層掃描,每個(gè)組織平均掃描時(shí)間為5min,掃描時(shí)共聚焦激光能量和亮度固定,以方便后續(xù)組織間灰度值的比較。獲取掃描部位組織,經(jīng)福爾馬林固定24小時(shí)后,脫水,包埋,切片制作,脫蠟,水化,蘇木素染色、分化、返藍(lán)、伊紅染色、梯度脫水,二甲苯透明后,用中性樹膠封片,以進(jìn)行HE染色獲取組織學(xué)診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”。(4)共聚焦圖像的分類：后期處理的實(shí)驗(yàn)結(jié)果過程中,將各個(gè)部位成像清晰的圖片再次收集并根據(jù)擬定的分級標(biāo)準(zhǔn)交由另兩位熟知共聚焦操作與成像的內(nèi)鏡醫(yī)師評定。評定主要考慮3個(gè)組織病理學(xué)因素,第一為腺腔形態(tài)的異常,其有助于鑒別正常粘膜,增生粘膜以及瘤／癌變粘膜；其次為細(xì)胞核的異型性,其有助于細(xì)分低級別上皮內(nèi)瘤變,高級別上皮內(nèi)瘤變及癌的分級；最后可根據(jù)圖片明暗的差異來區(qū)分正常部位與癌變部位。與此同時(shí),運(yùn)用靜脈內(nèi)注射熒光素鈉的共聚焦圖片也被納入其中,評定標(biāo)準(zhǔn)同前。病理診斷由2位專業(yè)的病理醫(yī)師根據(jù)Vienna分級評定。4、動物模型的構(gòu)建與共聚焦成像AOM/DSS化學(xué)誘導(dǎo)結(jié)腸癌模型構(gòu)建與成像：選取4-6周的Balb/c雄鼠,腹腔注射氧化偶氮甲烷(AOM)10mg/kg小鼠體重后,正常飲水1周。之后開始循環(huán),即連續(xù)飲2.5% DSS混合液7天,再正常飲水14天,循環(huán)三次。預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)腸道發(fā)生癌變的小鼠便血嚴(yán)重,且癌變的腸段可出現(xiàn)肉眼可見的腸壁增厚、僵硬等變化。實(shí)驗(yàn)前,小鼠禁食12小時(shí),后用戊巴比妥(0.01g/ml,劑量為6-7ul/g小鼠體重)腹腔注射麻醉,暴露腹腔,間斷分離長約1cm的結(jié)腸,以手術(shù)縫線結(jié)扎腸段兩端,結(jié)扎程度松緊適宜。用注射器吸取200u1250μmol/L的BODIPY-FA混合液注或500μmol/L 2-NBDG混合液或0.02%吖啶黃注射入結(jié)扎好的腸段內(nèi)。10分鐘后拆除縫線并沖洗,用棉簽擦拭干凈后,運(yùn)用共聚焦內(nèi)鏡在體觀察,觀察方法同前所述。內(nèi)鏡觀察結(jié)束后,實(shí)驗(yàn)者用29g注射器(吸取印度墨汁)準(zhǔn)確標(biāo)記經(jīng)內(nèi)鏡醫(yī)師判斷過的病變部位并放入OCT中包埋制作組織冰凍切片,冰凍切片的處理方法同前人離體組織的處理。5、分析及統(tǒng)計(jì)方法及采用雙盲法評價(jià)共聚焦內(nèi)鏡診斷結(jié)果平均灰度值與平均熒光強(qiáng)度使用Image J軟件分析,圖片選取的分析面積為100×100μm,同一病變選擇10個(gè)區(qū)域并取其平均值,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析采用SPSSv13.0統(tǒng)計(jì)軟件,兩組間比較根據(jù)不同的統(tǒng)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)運(yùn)用t檢驗(yàn),單因素/雙因素方差分析及非參數(shù)檢驗(yàn),取自腫瘤基因組學(xué)公開數(shù)據(jù)庫的95例癌癥與對應(yīng)正常組織的蛋白表達(dá)水平差異分析運(yùn)用Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)。共聚焦圖片與熒光素鈉圖片診斷與HE診斷的一致性評價(jià),.采用盲法,由兩位內(nèi)鏡醫(yī)師執(zhí)行,所有的數(shù)據(jù)運(yùn)用SAS 9.4軟件分析。診斷一致性及評價(jià)者之間的一致性評價(jià)運(yùn)用Kappa值(0.6代表一致性良好),P0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果1、FABP1、Caveolin-1和CD36在人結(jié)腸癌組織中表達(dá)降低根據(jù)蛋白組學(xué)分析數(shù)據(jù),我們檢測了一系列細(xì)胞膜脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白(包括FABP1、Caveolin-1、CD36、FABPpm及FATP4),Q-PCR結(jié)果顯示,與人正常的腸粘膜組織相比,腸癌組織中FABP1, Caveolin-1和CD36的mRNA表達(dá)水平分別下降了4.8倍,4.2倍,及20.9倍。同樣,在蛋白表達(dá)水平上,,腸癌組織中FABP1, Caveolin-1和CD36的蛋白質(zhì)水平相較于對應(yīng)的正常腸粘膜分別下降了1.8倍,2.5倍和2.3倍。免疫組化實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)與Q-PCR及western-blot所觀察到的現(xiàn)象一致,其中,CD36的表達(dá)在正常腸粘膜,低級別上皮內(nèi)瘤變,高級別上皮內(nèi)瘤變及癌組織中有明顯的逐漸遞減的趨勢,故我們猜測這三種蛋白的表達(dá)減少一方面可阻止腸癌細(xì)胞吸收外源性的脂肪酸,另一方面則間接使腸癌細(xì)胞內(nèi)脂肪酸合成增加。2、BODIPY-FA在大腸細(xì)胞內(nèi)的吸收及定位大腸粘膜上皮正常細(xì)胞株(FHC)對BODIPY-FA的吸收相較于結(jié)腸癌細(xì)胞株(SW480, HCT116, LOVO)多(P0.001)而且不同的腫瘤細(xì)胞間BODIPY-FA的吸收也存在差異,正常貼壁細(xì)胞吸收BODIPY-FA在15min內(nèi)不斷增加,而腫瘤細(xì)胞在15min時(shí)吸收趨緩。3對原代腸上皮細(xì)胞也表現(xiàn)了相同的吸收趨勢。激光共聚焦顯微鏡結(jié)果證實(shí)BODIPY-FA沉積于細(xì)胞質(zhì)與核周而不進(jìn)入細(xì)胞核,且FHC相較于腸癌細(xì)胞胞質(zhì)(SW480,LOVO)熒光強(qiáng)度更強(qiáng),吸收BODIPY-FA更多。3、熒光顯微鏡與共聚焦內(nèi)鏡成像顯示腸道腫瘤組織較對應(yīng)的正常腸粘膜吸收BODIPY-FA減少我們對50個(gè)不同的正常與腫瘤交界部位的熒光圖片進(jìn)行了分析(來自20例組織標(biāo)本),結(jié)果顯示：90%的圖片正常部位的平均熒光強(qiáng)度高于與其相鄰的腫瘤部位(正常：0.07±0.004,腫瘤：0.04±0.003,p0.0001)。共聚焦內(nèi)鏡成像過程中,我們發(fā)現(xiàn)所有的正常組織吸收的BODIPY-FA較癌組織明顯增多,甚至將共聚焦內(nèi)鏡的激發(fā)光強(qiáng)度減弱一半,正常組織顯像仍強(qiáng)于腫瘤組織。我們?nèi)缓蠓謩e對在同一強(qiáng)度激發(fā)光下成像的非瘤變(149),低級別瘤變(103),高級別瘤變(132)與癌變(124)圖像的灰度值進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)了非瘤變部位的平均灰度值較低級別瘤變,高級別瘤變及癌變部位分別增強(qiáng)了1.6倍,2倍及2.2倍,雖然高級別瘤變圖片與癌變圖片之間平均灰度值無明顯差異,證實(shí)了脂肪酸代謝的改變可能是腸道腫瘤發(fā)生過程中的早期事件。4、共聚焦內(nèi)鏡下BODIPY-FA的成像特點(diǎn)及診斷效能在共聚焦成像過程中我們發(fā)現(xiàn),BODIPY-FA成像可顯示正常粘膜腺體結(jié)構(gòu)、細(xì)胞排列、細(xì)胞核規(guī)則排列于基底側(cè)以及大量的杯狀細(xì)胞；在增生性息肉中,腺體結(jié)構(gòu)與細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本正常,可見星形的腺腔結(jié)構(gòu),杯狀細(xì)胞數(shù)量正常或輕度減少；腺癌成像中,腺體結(jié)構(gòu)極度扭曲或消失,同時(shí)伴“暗黑”的細(xì)胞核顯著增大及排列紊亂。在低級別上皮內(nèi)瘤變中,腺體結(jié)構(gòu)輕微異�；蜓娱L,細(xì)胞核仍位于基底一側(cè),核／胞漿的比例基本正常,杯狀細(xì)胞的數(shù)量略有減少,相反,在高級別上皮內(nèi)瘤變中,細(xì)胞核極性消失,隱窩極度延長或出現(xiàn)背靠背或融合現(xiàn)象,核／胞漿的比例失調(diào),杯狀細(xì)胞的數(shù)量減少或消失,細(xì)胞連接也消失。如同另一種形式的HE染色特異、直觀的展現(xiàn)觀察部位的病變情況,而這也是其突出于其他染色劑的優(yōu)勢.據(jù)統(tǒng)計(jì),評價(jià)者之間的診斷一致性良好(BODIPY-FA評價(jià),κ=0.72,熒光素鈉評價(jià),κ=0.61)。BODIPY-FA共聚焦成像與HE之間診斷無顯著差異性(χ2=3.29,p=0.6553)以及診斷一致性可達(dá)κ=0.68(p0.001),雖然熒光素鈉的診斷無顯著差異(χ2=1.10,p=0.9540),但其診斷的一致性僅為κ=0.43(P0.001)。5、激光共聚焦內(nèi)鏡下BODIPY-FA在活體小鼠腸癌模型中成像在離體組織,我們觀察到脂肪酸吸收的差異,故進(jìn)一步探討了在活體腸癌模型小鼠腸道中BODIPY-FA的吸收情況,以及將其同其他局部作用的染色劑(2NBDG,鹽酸丫啶黃(Acriflavine))的成像情況進(jìn)行了對比。在13只AOM/DSS化學(xué)誘導(dǎo)的腸癌小鼠中,其中8只行BODIPY-FA染色,2只行2-NBDG染色,最后3只小鼠行鹽酸吖啶黃染色。在AOM/DSS誘導(dǎo)的小鼠模型中,我們也觀察到了隨著小鼠腸道病變的惡化進(jìn)展,BODIPY-FA吸收遞減這一明顯的趨勢。在共聚焦內(nèi)鏡下,正常粘膜的平均灰度值相較于瘤變和癌變部位分別增強(qiáng)了2.5倍和1.7倍。此外,BODIPY-FA的染色在共聚焦內(nèi)鏡下能清晰的顯示細(xì)胞形態(tài),包括細(xì)胞排列的紊亂及細(xì)胞本身異型性的改變。而對比染色劑2-NBDG及鹽酸丫啶黃(Acriflavine)在腫瘤與正常組織中未顯現(xiàn)出強(qiáng)度差異,此外,2-NBDG局部染色顯像模糊,熒光信號弱,而吖啶黃染色的部位,雖能顯示胞核,但不同病變類型無差異。結(jié)論通過上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們得出以下結(jié)論：1、人結(jié)腸癌組織中FABP1、Caveolin-1和CD36的mRNA和蛋白表達(dá)顯著降低,提示了腸道腫瘤對脂肪酸吸收減少可能與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)下降有關(guān)。2、體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均證實(shí),隨著大腸腫瘤的惡化發(fā)展,腸道對脂肪酸的吸收遞減.3、BODIPY-FA是細(xì)胞質(zhì)染色劑,對病變進(jìn)行細(xì)胞、亞細(xì)胞水平的描述。其成像時(shí)間短,成像清晰,以及胞核顯像等優(yōu)點(diǎn)也許將使其作為共聚焦內(nèi)鏡的另一優(yōu)選染色劑,特別是在早癌診斷的應(yīng)用之中。4、 BODIPY-FA共聚焦內(nèi)鏡檢查對病變的診斷效能好,本研究為臨床實(shí)踐及科研工作提供了發(fā)現(xiàn)早期腫瘤的新思路,具有重要的價(jià)值。
【關(guān)鍵詞】：大腸腫瘤 激光共聚焦內(nèi)鏡 BODIPY-FA 脂肪酸代謝
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.34
【目錄】：

• 摘要3-13
• ABSTRACT13-27
• 第一章 前言27-33
• 第二章 材料和方法33-48
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料和試劑33-35
• 2. 實(shí)驗(yàn)儀器35
• 3. 實(shí)驗(yàn)方法35-48
• 第三章 結(jié)果48-61
• 1. FABP1、Caveolin-1和CD36在人結(jié)腸癌組織中表達(dá)降低48-50
• 2. BODIPY-FA在定位于細(xì)胞漿且腸癌細(xì)胞內(nèi)吸收減少50-52
• 3. 熒光顯微鏡顯示腸道腫瘤組織較對應(yīng)的正常腸粘膜吸收BODIPY-FA減少52-53
• 4. BODIPY-FA在共聚焦內(nèi)鏡下的成像特點(diǎn)及不同病變部位的吸收差異53-55
• 5. BODIPY-FA與熒光素鈉共聚焦成像的診斷效能55-57
• 6. 激光共聚焦內(nèi)鏡下BODIPY-FA在活體小鼠腸癌模型中成像57-61
• 第四章 討論61-64
• 參考文獻(xiàn)64-69
• 中英文縮略詞表69-70
• 攻讀學(xué)位期間成果70-71
• 課題經(jīng)費(fèi)來源71-72
• 致謝72-73

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7 宋e，

本文編號：1122676