本文關鍵詞：糖尿病大鼠頸性前庭誘發(fā)肌源性電位的觀察及其前庭外周傳入神經系統(tǒng)與坐骨神經的比較

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【摘要】：背景與目的糖尿病(diabetes mellitus, DM)是一種胰島素相對或絕對缺乏而使血糖水平異常增高、脂肪和蛋白質代謝紊亂的一種代謝紊亂性疾病。前庭平衡功能障礙是糖尿病并發(fā)癥之一。Lindsey等學者通過對糖尿病患者進行問卷調查發(fā)現65歲以上糖尿病患者摔倒年發(fā)生率是39%,是對照組的3倍。糖尿病患者出現姿勢不穩(wěn)、摔倒的風險增高,而引起患者前庭平衡功能障礙的病理生理基礎是高血糖導致的微血管病變及周圍神經病變。Erdem等對104例2型糖尿病患者與對照組間的前庭功能的視眼動系統(tǒng)檢查(包括凝視試驗、掃視試驗、平穩(wěn)跟蹤試驗、位置試驗等)均出現統(tǒng)計學差異。對于糖尿病患者前庭功能出現異常的研究報告并不多,而且研究結論不盡相同,這可能與樣本數量、年齡構成比例、病程不同有關。頸性前庭誘發(fā)肌源性電位(cervical vestibular evoked myogenic potentials,cVEMP)是通過用高強度的聲刺激在緊張的胸鎖乳突肌上記錄到來源于球囊的的肌電位。cVEMP傳導通路包括球囊斑、前庭下神經、前庭側核、前庭脊髓束及同側胸鎖乳突肌運動神經元,此通路上的各種病變均可導致cVEMP閾值升高、潛伏期延長、振幅降低乃至波形消失等。因此,可以用cVEMP來評價球囊和前庭下神經的功能。2014年Konukseven等對30例糖尿病患者、糖尿病前期患者及對照組進行眼性前庭誘發(fā)肌源性電位(ocular vestibular evoked myogenic potentials,oVEMP)和cVEMP檢測,發(fā)現在糖尿病組oVEMP和cVEMP的P1、N1潛伏期平均值較糖尿病前期及對照組顯著延長。目前雖已有諸多研究表明糖尿病會影響患者前庭功能,但因為臨床研究容易受到研究對象用藥、年齡及樣本量等因素的干擾,導致研究結果不盡相同,而且缺少相應的實驗病理模型說明其發(fā)生發(fā)展的機制。本實驗的第一部分通過建立糖尿病的大鼠模型,觀察糖尿病大鼠出現cVEMP閡值、P1潛伏期、N1潛伏期及P1-N1波間振幅出現異常的時間點,從而為進一步研究其病理機制提供理論基礎和實驗依據。有助于指導糖尿病患者對平衡功能損傷相關并發(fā)癥進行早期干預,從而減少糖尿病患者因平衡功能障礙所致的摔倒、傷殘等嚴重后果。糖尿病周圍神經病變(diabetic peripheral neuropathy,DPN)是糖尿病最常見的并發(fā)癥,也是糖尿病患者致殘的主要因素,表現為多發(fā)性神經病,其病理改變多為節(jié)段性脫髓鞘及軸索變性,并以軸索變性為主。目前對于糖尿病大鼠坐骨神經的形態(tài)學研究已較多,多數研究顯示糖尿病在第4周便出現了髓鞘斷裂,并隨著病程的延長出現了節(jié)段性脫髓鞘及軸索萎縮等現象。然而對于糖尿病前庭下神經以及球囊的顯微形態(tài)學觀察卻極少,僅在1999年Myers等發(fā)現糖尿病組大鼠出現前庭神經纖維直徑變小以及神經髓鞘變薄,并且這種改變隨著患病時間的增加更嚴重,但是國內外均無針對前庭神經及耳石器較長時間的形態(tài)學動態(tài)研究觀察。本研究的第二部分通過建立糖尿病的大鼠模型,從造模成功后分成5個時間段來動態(tài)觀察前庭下神經超微結構以及球囊斑病理形態(tài)學的改變,并將其與坐骨神經出現損害的時間點相比較,以完善與豐富糖尿病對外周前庭器官損害的基礎研究,從而為指導臨床診治與預防提供新的思路與方法。方法1、動物分組及糖尿病模型的制備：雄性SD大鼠,體重300-350g(購于南方醫(yī)科大學實驗動物中心),耳廓反應靈敏、鼓膜標志正常、無自發(fā)性眼震。適應性飼養(yǎng)1周后進行糖尿病造模。將動物隨機分為對照組及糖尿病組,再按照觀察時間將糖尿病組分為糖尿病4周組、糖尿病6周組、糖尿病8周組、糖尿病10周組及糖尿病12周組,共5組,每組40只大鼠；對照組20只。2、糖尿病大鼠模型制備：鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ)使用前以0.1mol/L、pH4.2-4.6的檸檬酸緩沖液配制成的1%STZ溶液,糖尿病組大鼠按照55mg/kg體重一次性腹腔注射STZ,對照組予腹腔注射等量檸檬酸緩沖液。注射STZ后第7天測量大鼠尾靜脈隨機微量血糖,血糖大于16.7mmol/L則造模成功。此后每隔一周測一次尾靜脈微量血糖。3、ABR檢測：應用Smart EP聽覺誘發(fā)電位儀(美國智聽系統(tǒng)公司)檢測大鼠ABR閾值。用2%戊巴比妥鈉以0.2ml/100g將大鼠麻醉后,將銀針電極的記錄電極置于顱頂正中皮下,參考電極置于同側乳突,接地電極置于后足部。刺激聲為疏密相交替的12.1次/s的短聲(click),持續(xù)時間為0.1 ms,帶通濾波300-3000 Hz,觀察時程20 ms,疊加次數1024次。在距外耳道口1.5 cm處通過插入式耳機給聲,刺激聲從100dB SPL開始,以10 dB遞減。以能分辨出ABR波型中Ⅲ波的最低刺激強度確定ABR閾值。4、cVEMP檢測：應用美國GSI公司Audera V2.7聽覺誘發(fā)電位儀檢測大鼠cVEMP結果。用2%戊巴比妥鈉以0.2ml/100g將大鼠麻醉,記錄時將大鼠頭部抬起,向前上方牽引,使頸部肌肉盡量處于過伸狀態(tài)。采用銀針插入電極,于雙側背部頸伸肌平C3頸椎棘突水平插入記錄電極,枕骨正中線插入參考電極,后足部插入接地電極。插入式耳機固定于外耳道深部0.5cm處,刺激聲為click,交替波,刺激強度由100dB nHL開始,10dB nHL遞減,重復率為5.00 Hz,掃描204次,掃描時間40s,帶通濾波10Hz～1000Hz。記錄糖尿病不同時期cVEMP的反應情況,記錄閾值、各波潛伏期及振幅值。每側耳均接受兩次cVEMP測試,各項指標取其平均值。將記錄到的第一個雙相波分別命名為P1(正波)和N1(負波),P1和N1出現即可認為cVEMP引出,閾值為能引出cVEMP的最小刺激強度,絕對峰間振幅為P1-N1之間的波間振幅。分析糖尿病不同時期與對照組cVEMP閾值、P1潛伏期、N1潛伏期以及P1-N1波間振幅之間的關系。5、形態(tài)學研究：選擇30只雄性SD大鼠,動物隨機分為對照組及糖尿病組,再按照觀察時間將糖尿病組分為糖尿病4周組、糖尿病6周組、糖尿病8周組、糖尿病10周組及糖尿病12周組,用2%戊巴比妥鈉將大鼠麻醉,剪開胸腔,暴露心臟,用生理鹽水及4%多聚甲醛溶液從左心室穿刺進行灌注固定,迅速將大鼠斷頭,去除腦組織,暴露顱底,取出并打開聽泡,放置0.01mol/L磷酸鹽緩沖液,在解剖顯微鏡下刺破圓窗膜,將鐙骨底板脫位暴露卵圓窗。在蝸頂鉆一小孔,用微量注射器緩慢注入4%多聚甲醛固定液至少5次,置于4%多聚甲醛固定液過夜。將標本進行脫鈣、梯度脫水、透明、浸蠟,按與蝸軸平行方向包埋,平行蝸軸4μm厚度連續(xù)切片,再進行HE染色,每組取前庭球囊標本觀察球囊斑超微結構如前庭毛細胞的形態(tài)、支持細胞、毛細胞纖毛。6、透射電鏡研究：選擇30只雄性SD大鼠,動物隨機分為對照組及糖尿病組,再按照觀察時間將糖尿病組分為糖尿病4周組、糖尿病6周組、糖尿病8周組、糖尿病10周組及糖尿病12周組,用2%戊巴比妥鈉將大鼠麻醉,剪開胸腔,暴露心臟,用生理鹽水及2.5%戊二醛溶液從左心室穿刺進行灌注固定,分別取出大鼠坐骨神經及在解剖顯微鏡下取出前庭下神經,放入戊二醛固定液中室溫下過夜。將標本脫水、滲透與包埋、超薄切片、染色。在電鏡下觀察每組前庭下神經及坐骨神經標本有髓神經纖維超微結構如軸索、髓鞘、線粒體形態(tài)。7、統(tǒng)計學分析：采用SPSS 19.0軟件對結果進行處理,計量資料以x±s表示,糖尿病組與對照組之間的cVEMP各項參數比較采用單向方差分析(One-Way ANOVA),P0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。結果1、糖尿病組大鼠與對照組相比,糖尿病組大鼠出現多飲多食多尿,體重下降等典型糖尿病癥狀,精神萎靡,活動力下降,毛發(fā)發(fā)黃,后期有部分糖尿病大鼠出現視網膜病變、壞疽、腹水等癥狀。總造模成模率76.5%(153/200),總死亡率22.22%(34/153)。正常對照組生長營養(yǎng)狀況良好,未出現以上表現。各組糖尿病大鼠與對照組相比,血糖明顯升高(F=64.07,P0.01),體重明顯下降(F=17.44,P0.01),均具有統(tǒng)計學差異,說明造模成功。2、ABR對照組與糖尿病不同時期組ABR的閾值(dB SPL)具有統(tǒng)計學差異(F=44.86,P0.01),糖尿病第4周(35.50±2.84 dB SPL)的閾值與對照組(32.50±3.53 dB SPL)比較無明顯統(tǒng)計學差異(P0.05),而糖尿病第6周(41.00±3.94 dB SPL).第8周(46.50±5.80 dB SPL).第10周(50.00±4.08 dB SPL).第12周(58.00±5.87 dB SPL)的閾值與對照組比較具有明顯統(tǒng)計學差異(P0.05)。3、對照組與糖尿病不同時期組cVEMP的閾值具有統(tǒng)計學差異(F=27.65,P0.01),對照組與各糖尿病組分別進行方差分析,糖尿病第4周(42.00±8.94 dB nHL).第6周(41.33±10.08 dB nHL)的閾值與對照組(42.86±11.89 dB nHL)比較無明顯統(tǒng)計學差異(P0.05),而糖尿病第8周(53.87±11.16 dB nHL,P0.05)、第10周(67.00±12.74 dB nHL).第12周(67.00±9.23 dB nHL)的閾值與對照組比較具有明顯統(tǒng)計學差異(P0.01)。對照組與糖尿病不同時期組的cVEMP的P1潛伏期具有統(tǒng)計學差異(F=16.70,P0.01),各糖尿病組與對照組分別進行方差分析,糖尿病第4周(4.65±0.36 ms)、第6周(4.82±0.28ms)的P1潛伏期與對照組(4.64±0.52 ms)比較無明顯統(tǒng)計學差異(P0.05),而糖尿病第8周(5.01±0.33 ms,P0.05)、第10周(5.37±0.45 ms,P0.01)、第12周(5.39±0.24 ms,P0.01)的P1潛伏期與對照組比較具有明顯統(tǒng)計學差異。對照組與糖尿病不同時期組的cVEMP的N1潛伏期具有統(tǒng)計學差異(F=18.21,P0.01),各糖尿病組與對照組分別進行方差分析,糖尿病第4周(7.90±0.73 ms)、第6周(7.98±0.75 ms)、第8周(7.77±0.54 ms)的N1潛伏期與對照組(7.79±0.55 ms)比較無明顯統(tǒng)計學差異(P0.05),而糖尿病第10周(8.98±0.86 ms,P0.01)、第12周(9.08±0.45 ms,P0.01)的N1潛伏期與對照組比較具有明顯統(tǒng)計學差異。只有對照組與糖尿病不同時期組的cVEMP的P1-N1波振幅不具有統(tǒng)計學差異(F=0.87,P0.05)。4、糖尿病各組球囊斑HE染色結果顯示,與對照組比較球囊斑超微結構,如前庭毛細胞的形態(tài)、支持細胞、毛細胞纖毛等均未發(fā)現明顯改變,無細胞萎縮、水腫、纖毛倒伏等病理改變。5、電鏡結果顯示坐骨神經較前庭下神經更早出現超微結構的改變。在糖尿病成模后第4周坐骨神經開始出現神經形態(tài)學改變,并且隨著病程的延長,形態(tài)學改變更嚴重。前庭下神經顯示,糖尿病第4周組、第6周有髓神經纖維的結構與正常組并未出現明顯改變,有髓神經纖維髓鞘結構清晰完整,軸索胞質飽滿,線粒體結構完整。從第8周開始出現了明顯結構改變,并且視野內病變的范圍較大,髓鞘出現斷裂、脫落,但軸索完整,未與髓鞘脫離,第10周出現節(jié)段性脫髓鞘,軸索萎縮,與髓鞘分離,第12周病變更嚴重范圍更廣,髓鞘崩解,軸索胞漿及雪旺氏細胞(SC)內出現溶酶體。結論1、研究結果表明糖尿病大鼠從第8周開始便可出現外周前庭終器及前庭傳導通路的的損傷,表現為明顯閾值提高、P1潛伏期的延長,在早期便可出現外周前庭損傷,糖尿病的嚴重程度與病程時長都會對其前庭功能產生影響,cVEMP可作為早期診斷方法之一,為進一步研究其病理機制提供了一定的理論基礎和實驗方法。通過對更長時間的動物模型和治療觀察等進一步的研究,將有助于提高對糖尿病患者前庭功能障礙的診斷水平,對可引起平衡功能損傷的相關并發(fā)癥進行早期干預,從而減少糖尿病患者因平衡功能障礙所致的摔倒、傷殘等嚴重后果,提高糖尿病患者的生活質量。2、在本研究中,糖尿病前庭下神經較坐骨神經更遲出現有髓神經纖維形態(tài)結構學改變,糖尿病大鼠在第4周開始出現坐骨神經超微結構改變,髓鞘斷裂、分離,并隨著病程的延長逐漸出現節(jié)段性脫髓鞘、軸索萎縮變性等結構改變。而前庭下神經從第8周才開始出現了結構改變,并且隨著病程的延長超微結構破壞更嚴重。對進一步研究其病理機制提供了一定的理論基礎和實驗方法,通過對更長時間的動物模型和治療觀察等進一步的研究,并且可通過施加干預因素來觀察對出現坐骨神經病變的大鼠前庭功能的改變,這些將有助于提高對糖尿病患者前庭功能障礙預防與診斷水平,提高糖尿病患者的生活質量。3、本實驗研究中,糖尿病大鼠雖然在第8周開始出現前庭下神經的有髓神經纖維的結構改變、損害,但各組的球囊的前庭毛細胞、支持細胞等結構較正常對照組均未發(fā)現明顯異常,推斷可能球囊的前庭毛細胞、支持細胞的存活并不依賴于前庭下神經結構完整與功能正常。糖尿病第8周出現cVEMP的異�？赡芘c有髓神經纖維受損有關,而球囊斑前庭毛細胞雖暫未發(fā)現明顯病變,但無法完全否定其對cVEMP異常的影響,其機制尚需進一步探討,推測在糖尿病早期前庭功能障礙中前庭神經的損害可能起到更關鍵的作用。綜上所述,糖尿病大鼠第4周開始出現坐骨神經結構改變,第8周出現cVEMP異常及前庭下神經超微結構改變,并隨著病程的延長損害更嚴重,但未發(fā)現明顯的球囊斑的形態(tài)學改變。糖尿病大鼠在早期便可出現外周前庭損傷,cVEMP可作為早期診斷方法之一,同時也發(fā)現糖尿病前庭下神經較坐骨神經更遲出現有髓神經纖維形態(tài)結構學改變,對進一步研究其病理機制提供了一定的理論基礎和實驗方法。當出現了周圍神經系統(tǒng)癥狀而缺乏相應的前庭功能癥狀時,應盡早對患者進行前庭系統(tǒng)功能的評估,以預防及減少對可引起平衡功能損傷的相關并發(fā)癥,從而減少糖尿病患者因平衡功能障礙所致的摔倒、傷殘等嚴重后果。后期可通過對更長時間的動物模型和治療觀察,并且可施加干預因素來觀察對出現坐骨神經病變的大鼠前庭功能的改變,進一步研究糖尿病對前庭功能障礙的機制,這些將有助于提高對糖尿病患者前庭功能障礙預防與診斷水平,提高糖尿病患者的生活質量。
【關鍵詞】：糖尿病大鼠 cVEMP 坐骨神經 前庭下神經 球囊 外周前庭功能障礙
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R587.2;R764
【目錄】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-18
• 前言18-25
• 第一章 糖尿病大鼠頸性前庭誘發(fā)肌源性電位的觀察25-38
• 1 材料與方法26-28
• 2 結果28-33
• 3 討論33-35
• 參考文獻35-38
• 第二章 糖尿病大鼠前庭外周傳入神經系統(tǒng)與坐骨神經的比較38-56
• 1 材料與方法38-43
• 2 結果43-50
• 3 討論50-53
• 參考文獻53-56
• 攻讀學位期間成果56-57
• 綜述57-68
• 參考文獻64-68
• 英文縮寫注解68-69
• 存在的問題及后續(xù)需要解決的問題69-70
• 致謝70-72

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本文編號：1099192