本文關(guān)鍵詞：丙酮酸鈉減輕紅細(xì)胞儲存損傷及輸注后肝損傷的研究

  更多相關(guān)文章： 紅細(xì)胞 儲存損傷 丙酮酸鈉 回輸不良反應(yīng)

【摘要】：紅細(xì)胞(red blood cell,RBC)是機(jī)體血液的主要組分,主要功能是運(yùn)輸氧氣和二氧化碳。臨床中,對于創(chuàng)傷或者術(shù)中大量出血的患者,輸血是一種基本的治療手段。臨床中患者輸注的紅細(xì)胞多為儲存紅細(xì)胞,醫(yī)院采用“先進(jìn)先出”的原則為患者輸血。紅細(xì)胞儲存過程中不可避免的發(fā)生一系列生理生化、形態(tài)結(jié)構(gòu)及功能變化,如能量代謝障礙、氧化應(yīng)激水平升高、細(xì)胞內(nèi)p H下降、紅細(xì)胞變形性及攜氧能力下降等,這些統(tǒng)稱為“儲存損傷”。紅細(xì)胞儲存損傷可以導(dǎo)致紅細(xì)胞回輸不良反應(yīng)。動物實驗表明,相對于新鮮紅細(xì)胞,儲存時間為7天的紅細(xì)胞變形性顯著下降,回輸后會加重失血性休克復(fù)蘇后急性肝損傷。另外,回輸紅細(xì)胞的儲存時間延長還會導(dǎo)致肺炎比格犬模型的死亡率增加。臨床研究中,在創(chuàng)傷、危重癥或圍術(shù)期等患者中,儲存紅細(xì)胞輸注與輸血相關(guān)急性肺損傷、多器官功能障礙及感染率和死亡率增加等不良反應(yīng)密切相關(guān)。盡管大量研究揭示紅細(xì)胞儲存損傷與紅細(xì)胞回輸不良反應(yīng)密切相關(guān),但是,儲存紅細(xì)胞回輸不良反應(yīng)的確切機(jī)制尚不明確。目前有一氧化氮(Nitric oxide,NO)活性喪失、能量耗竭、游離血紅蛋白氧化損傷、變形性下降、鐵超載等多種假說解釋紅細(xì)胞回輸不良反應(yīng)的發(fā)生�；谝陨霞僬f進(jìn)行的研究發(fā)現(xiàn),吸入NO、洗滌紅細(xì)胞或復(fù)狀液處理儲存紅細(xì)胞等方法可以緩解或減少儲存紅細(xì)胞回輸不良反應(yīng)的發(fā)生。然而,以上方法大多是在紅細(xì)胞發(fā)生不可逆損傷以后的補(bǔ)救措施,如果在紅細(xì)胞儲存過程中,抑制紅細(xì)胞儲存損傷的發(fā)生,可能會獲得更大的治療益處。根據(jù)美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)標(biāo)準(zhǔn),紅細(xì)胞經(jīng)過體外儲存后溶血率應(yīng)小于1%,回輸至受體24小時后紅細(xì)胞的恢復(fù)率應(yīng)大于75%。紅細(xì)胞儲存后溶血率、存活率及儲存損傷與紅細(xì)胞保存液成分密切相關(guān)。自1915年,Rous和Turner首次將枸櫞酸和葡萄糖混合溶液用于紅細(xì)胞體外儲存以來,紅細(xì)胞保存液的組成不斷改進(jìn)。目前,臨床上4℃儲存紅細(xì)胞時間上限為42天,主要應(yīng)用CPDA-1、氯化鈉-腺膘呤-葡萄糖-甘露醇(SAGM)等紅細(xì)胞保存液保存紅細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn),通過改進(jìn)紅細(xì)胞保存液的組成和理化性質(zhì)可以改善儲存紅細(xì)胞能量代謝,減輕儲存損傷,延長了紅細(xì)胞的儲存時間。在儲存過程中,紅細(xì)胞能量代謝發(fā)生障礙,添加能量代謝底物葡萄糖儲存紅細(xì)胞,可有效改善紅細(xì)胞能量代謝,降低儲存紅細(xì)胞溶血率。儲存過程中,紅細(xì)胞內(nèi)抗氧化能力下降,氧自由基會直接氧化細(xì)胞膜及胞中關(guān)鍵蛋白,造成不可逆的氧化損傷,而目前紅細(xì)胞保存液中缺乏抗氧化成分。Stowell等發(fā)現(xiàn),在紅細(xì)胞儲存過程中添加抗氧化劑維生素C儲存紅細(xì)胞,盡管可有效提高儲存紅細(xì)胞回輸存活率,并且降低免疫原性,但是研究同時發(fā)現(xiàn)添加維生素C儲存紅細(xì)胞回輸后并不能改善機(jī)體炎性反應(yīng)。一直以來對紅細(xì)胞儲存損傷及其回輸不良反應(yīng)的研究從未停歇,但是紅細(xì)胞在儲存過程中發(fā)生的儲存損傷仍未得到實質(zhì)性改善,并導(dǎo)致紅細(xì)胞回輸不良反應(yīng)的發(fā)生。因此,在紅細(xì)胞儲存過程中,添加物質(zhì)可能改善紅細(xì)胞儲存損傷,降低回輸不良反應(yīng)。丙酮酸鈉(sodium pyruvate,SP)是丙酮酸的鈉鹽。丙酮酸是糖代謝途徑中的關(guān)鍵中間產(chǎn)物,既可進(jìn)入三羧酸循環(huán)參與有氧代謝,生成二氧化碳、水,并產(chǎn)生能量,也可進(jìn)行無氧酵解轉(zhuǎn)變?yōu)槿樗?伴隨產(chǎn)生能量。丙酮酸鈉具有抗氧化、抗炎、保護(hù)器官和糾正酸中毒等作用。已有研究表明,使用添加丙酮酸鈉的復(fù)狀液對儲存紅細(xì)胞進(jìn)行處理,發(fā)現(xiàn)能夠增加儲存紅細(xì)胞ATP和2,3-DPG的水平,改善紅細(xì)胞功能。然而,由于紅細(xì)胞在儲存過程中發(fā)生不可逆的儲存損傷,因此在回輸前采用含有丙酮酸鈉成分的復(fù)狀液處理紅細(xì)胞不能完全逆轉(zhuǎn)儲存損傷。目前,在紅細(xì)胞儲存過程中添加丙酮酸鈉對儲存紅細(xì)胞攜氧能力、氧化應(yīng)激水平等儲存損傷及回輸造成的不良反應(yīng)的影響未見報道。我們推測,在紅細(xì)胞儲存過程中添加丙酮酸鈉,可以有效改善紅細(xì)胞儲存損傷,減輕回輸不良反應(yīng)。小鼠儲存紅細(xì)胞回輸模型是研究儲存紅細(xì)胞回輸不良反應(yīng)的常用動物模型。研究表明,儲存14天的小鼠紅細(xì)胞和儲存42天的人類紅細(xì)胞經(jīng)歷了相似的形態(tài)功能的變化,并且具有相似的生理生化狀態(tài)。因此,本研究擬用儲存14天的小鼠紅細(xì)胞模擬人類儲存紅細(xì)胞,建立小鼠儲存紅細(xì)胞平臺,研究丙酮酸鈉對紅細(xì)胞儲存損傷的改善作用,并進(jìn)一步探討丙酮酸鈉在減輕儲存紅細(xì)胞回輸不良反應(yīng)中的作用。第一部分小鼠體外儲存紅細(xì)胞平臺的建立本研究擬探討在紅細(xì)胞儲存過程中添加丙酮酸鈉對儲存紅細(xì)胞氧化應(yīng)激水平、攜氧能力等儲存損傷及回輸不良反應(yīng)的影響,首先需要建立小鼠體外儲存紅細(xì)胞平臺。戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠(其注射量按75mg/kg體重計算),放于超凈工作臺中,用75%酒精消毒動物手術(shù)區(qū)域及手術(shù)器械,同時機(jī)械通氣,通過心臟穿刺取血,CPDA-1作為抗凝劑和儲存液,終濃度為14%,用白細(xì)胞濾器過濾去除全血中的白細(xì)胞,4℃條件下,400g離心15分鐘,去上清,調(diào)整紅細(xì)胞壓積為70-75%,血液保存冰箱4℃儲存。儲存時間小于2小時的作為新鮮紅細(xì)胞(FRBC),儲存時間為14天的作為儲存紅細(xì)胞(SRBC)。測定新鮮紅細(xì)胞和儲存紅細(xì)胞的血?dú)庵笜?biāo),血常規(guī)指標(biāo),紅細(xì)胞攜氧能力,紅細(xì)胞溶血率和24小時回輸存活率。結(jié)果表明,相較于新鮮紅細(xì)胞,紅細(xì)胞在儲存的過程中,紅細(xì)胞液中鈉離子濃度顯著降低,鉀離子濃度顯著升高(p(27)0.05)。相較于新鮮紅細(xì)胞,紅細(xì)胞在儲存的過程中,溶血率顯著升高(p(27)0.05),24小時回輸存活率顯著降低(p(27)0.05),紅細(xì)胞P50值顯著降低(p(27)0.05)。本實驗結(jié)果提示,紅細(xì)胞在儲存過程中,紅細(xì)胞氧分壓下降,酸堿平衡受到破壞,紅細(xì)胞內(nèi)外鈉鉀離子分布異常,攜氧能力降低等。本部分研究成功建立了小鼠儲存紅細(xì)胞體外實驗平臺,為丙酮酸鈉在紅細(xì)胞儲存過程中的作用評價實驗奠定基礎(chǔ)。第二部分丙酮酸鈉對紅細(xì)胞儲存損傷保護(hù)作用的研究本部分研究擬在第一部分構(gòu)建的小鼠儲存紅細(xì)胞實驗平臺基礎(chǔ)上,探究丙酮酸鈉在紅細(xì)胞儲存過程中對紅細(xì)胞儲存損傷的保護(hù)作用。如第一部分所述方法制備去白全血,平均分2組(n=8):1)丙酮酸鈉(Sodium pyruvate,SP)組,添加丙酮酸鈉濃縮液使儲存紅細(xì)胞中丙酮酸鈉的終濃度為2.5m M;2)對照(Control)組,按相同體積比加入等量的生理鹽水。離心,棄上清以調(diào)整紅細(xì)胞壓積為70%-75%,4℃儲存14天后,測定紅細(xì)胞的血?dú)庵笜?biāo)、血常規(guī)指標(biāo)、攜氧能力、ATP水平、氧化應(yīng)激水平、溶血率和回輸24小時存活率。結(jié)果表明,與對照組比較,丙酮酸鈉組總血紅蛋白濃度、紅細(xì)胞壓積、平均紅細(xì)胞體積無顯著性差異;與對照組比較,丙酮酸鈉組儲存紅細(xì)胞ATP含量顯著升高(p(27)0.05),丙二醛(MDA)水平顯著降低(p(27)0.05),超氧化物歧化酶(SOD)活性顯著升高(p(27)0.05),P50水平顯著升高(p(27)0.05)。與對照組相比較,丙酮酸鈉組儲存紅細(xì)胞溶血率有下降趨勢,回輸24小時存活率有升高趨勢,但兩組之間都無統(tǒng)計學(xué)差異(p(29)0.05)。實驗結(jié)果顯示,在紅細(xì)胞儲存過程中,添加丙酮酸鈉對總血紅蛋白濃度、紅細(xì)胞壓積、平均紅細(xì)胞體積無明顯影響,但在紅細(xì)胞儲存過程中添加丙酮酸鈉能夠維持細(xì)胞內(nèi)ATP濃度和儲存紅細(xì)胞攜氧能力,提高儲存紅細(xì)胞抗氧化能力,減少紅細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。第三部分丙酮酸鈉對儲存紅細(xì)胞回輸后肝損傷的影響本部分以小鼠儲存紅細(xì)胞實驗平臺為基礎(chǔ),研究在紅細(xì)胞儲存過程中添加丙酮酸鈉對儲存紅細(xì)胞回輸造成的肝損傷的影響。如第二部分所述方法,制備添加丙酮酸鈉的儲存紅細(xì)胞及對照組儲存紅細(xì)胞。通過尾靜脈注射的方法,分別注射對照組和丙酮酸鈉組儲存紅細(xì)胞,注射量為小鼠總血量的20%,回輸2小時后,戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠(其注射量按75mg/kg體重計算),機(jī)械通氣,心臟穿刺取血,全血以6000rpm轉(zhuǎn)速離心90秒,取上層血漿并分裝,-80℃保存。取肝臟組織,一部分放入液氮中保存,另一部分用4%多聚甲醛固定。測定小鼠血漿生化水平,主要有谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、血尿素氮(BUN)和乳酸脫氫酶(LDH),測定小鼠肝組織MDA水平,髓過氧化物酶(MPO)活性,白介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平,在此基礎(chǔ)上,通過HE染色,觀察小鼠肝組織病理變化。結(jié)果表明,相較于對照組,丙酮酸鈉組小鼠血漿中AST活性顯著降低(p(27)0.05);BUN水平降低(p(27)0.05);LDH活性降低(p(27)0.05)。相較于對照組,丙酮酸鈉組小鼠肝組織MDA水平、MPO活性、IL-6和TNF-α水平都顯著性降低(p(27)0.05);病理組織結(jié)果顯示,相較于對照組,丙酮酸鈉組小鼠肝組織出現(xiàn)較少的細(xì)胞壞死灶和中性粒細(xì)胞浸潤。本實驗結(jié)果顯示,紅細(xì)胞在儲存過程中添加丙酮酸鈉,可顯著降低儲存紅細(xì)胞回輸造成的機(jī)體氧化應(yīng)激水平和炎癥反應(yīng)水平升高,改善器官損傷。綜上所述,本研究基于小鼠紅細(xì)胞儲存模型,評價紅細(xì)胞儲存過程中添加丙酮酸鈉對紅細(xì)胞儲存損傷的影響,并進(jìn)一步探討紅細(xì)胞在儲存過程中添加丙酮酸鈉對回輸后肝損傷的影響。研究結(jié)果表明,在紅細(xì)胞儲存過程中,添加丙酮酸鈉能夠改善儲存紅細(xì)胞能量代謝障礙、氧化應(yīng)激損傷及攜氧能力,并可顯著改善儲存紅細(xì)胞回輸后肝損傷。本研究為紅細(xì)胞儲存液的改進(jìn)以及儲存紅細(xì)胞回輸不良反應(yīng)的預(yù)防提供新思路和實驗依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：紅細(xì)胞 儲存損傷 丙酮酸鈉 回輸不良反應(yīng)
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R457.1
【目錄】：

• 縮略詞表5-6
• 中文摘要6-10
• Abstract10-16
• 前言16-19
• 第一章 小鼠儲存紅細(xì)胞體外實驗平臺的建立19-29
• 1.1 材料19-21
• 1.1.1 實驗動物19
• 1.1.2 主要試劑19-20
• 1.1.3 儀器和耗材20
• 1.1.4 溶液配制20-21
• 1.2 方法21-23
• 1.2.1 小鼠紅細(xì)胞的制備和儲存21
• 1.2.2 小鼠紅細(xì)胞的血?dú)夥治龊脱Ｒ?guī)測定21
• 1.2.3 紅細(xì)胞攜氧/釋氧能力測定21-22
• 1.2.4 紅細(xì)胞溶血率的測定22-23
• 1.2.5 紅細(xì)胞回輸24小時存活率的測定23
• 1.2.6 統(tǒng)計學(xué)分析23
• 1.3 結(jié)果23-26
• 1.3.1 小鼠紅細(xì)胞血?dú)夥治�、血常�?guī)、溶血率和攜氧/釋氧能力變化23-25
• 1.3.2 紅細(xì)胞回輸24小時存活率25-26
• 1.4 討論26-28
• 本章小結(jié)28-29
• 第二章 丙酮酸鈉對紅細(xì)胞儲存損傷保護(hù)作用的研究29-43
• 2.1 材料29-31
• 2.1.1 實驗動物29-30
• 2.1.2 主要試劑30
• 2.1.3 儀器和耗材30-31
• 2.1.4 溶液配制31
• 2.2 方法31-36
• 2.2.1 小鼠紅細(xì)胞的儲存和分組31-32
• 2.2.2 儲存紅細(xì)胞血?dú)夥治�、血常�?guī)測定、紅細(xì)胞攜氧/釋氧能力的測定32-33
• 2.2.3 儲存紅細(xì)胞溶血率測定33
• 2.2.4 儲存紅細(xì)胞回輸24小時存活率測定33
• 2.2.5 紅細(xì)胞ATP、MDA水平和SOD活性測定33-36
• 2.2.6 統(tǒng)計學(xué)分析36
• 2.3 結(jié)果36-40
• 2.3.1 血?dú)夂脱Ｒ?guī)測定結(jié)果36-37
• 2.3.2 紅細(xì)胞攜氧能力測定37
• 2.3.3 儲存紅細(xì)胞溶血率和回輸24小時存活率37-38
• 2.3.4 儲存紅細(xì)胞中ATP含量測定38-39
• 2.3.5 儲存紅細(xì)胞氧化應(yīng)激水平39-40
• 2.4 討論40-42
• 本章小結(jié)42-43
• 第三章 丙酮酸鈉對儲存紅細(xì)胞回輸后肝損傷的影響43-56
• 3.1 材料43-45
• 3.1.1 實驗動物43
• 3.1.2 主要試劑43-44
• 3.1.3 儀器和耗材44
• 3.1.4 溶液配制44-45
• 3.2 方法45-49
• 3.2.1 小鼠紅細(xì)胞的儲存與分組45
• 3.2.2 儲存紅細(xì)胞的回輸45-46
• 3.2.3 組織樣本的采集46
• 3.2.4 血漿中AST活性、BUN含量和LDH活性的測定46
• 3.2.5 肝組織氧化應(yīng)激水平檢測46-47
• 3.2.6 肝組織中MPO活性、IL-6 和TNF-α 含量測定47-48
• 3.2.7 肝組織病理分析48-49
• 3.2.8 統(tǒng)計學(xué)分析49
• 3.3 結(jié)果49-53
• 3.3.1 血漿中AST活性、BUN含量和LDH活性49-51
• 3.3.2 肝組織氧化應(yīng)激水平51
• 3.3.3 肝組織中MPO活性、IL-6 和TNF-α 含量51-52
• 3.3.4 肝組織病理損傷52-53
• 3.4 討論53-55
• 本章小結(jié)55-56
• 總結(jié)56-58
• 參考文獻(xiàn)58-64
• 個人簡歷64-65
• 致謝65-66

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本文編號：1083971