本文關(guān)鍵詞：紅花黃色素對控制性低血壓誘導(dǎo)的缺血缺氧性腦損傷的影響及機制研究

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【摘要】：研究背景控制性低血壓(Controlled Hypotention, CH)是一種根據(jù)患者手術(shù)以及病情的需要而廣泛應(yīng)用于臨床的麻醉技術(shù)。其目的是減少出血、改善術(shù)野環(huán)境、減少輸血,提高手術(shù)期的安全性。然而,患者在手術(shù)期間由于其自身條件、手術(shù)以及麻醉操作和藥物等因素,�？沙霈F(xiàn)心率變慢、血壓下降以及呼吸抑制等癥狀,加上控制性低血壓期間常常很難保證重要器官的血液灌注以及氧的供應(yīng),尤其是大幅度降壓后更易誘發(fā)組織器官的缺血缺氧性損害,而腦組織又因其代謝強、缺氧耐受差等特點,相比其他器官更易受到損傷。因此控制性低血壓期間最大的顧慮是腦供血不足和腦缺氧引起的腦損傷以及復(fù)壓后的再灌注損傷。缺血缺氧性腦損傷包括缺血期的原發(fā)性腦損傷和再灌注期的繼發(fā)性腦損傷。診治腦缺血的根本則是在有效時間窗內(nèi)盡快消除缺血原因、恢復(fù)血液灌流。然而,灌注后的繼發(fā)性損傷卻是很難避免的,其程度直接影響腦損傷的預(yù)后。繼發(fā)性腦損傷即腦缺血再灌注損傷(CIRI)是指缺血腦組織在發(fā)生細胞壞死前,缺血組織恢復(fù)血液灌注后,其功能不但未能完全恢復(fù),且可能在原來損傷的基礎(chǔ)上出現(xiàn)進一步加重的現(xiàn)象。CIRI是一個復(fù)雜的病理生理過程,其發(fā)病機制涉及多個方面,主要包括：興奮性氨基酸的毒性、鈣超載、線粒體能量代謝障礙及酸中毒、自由基和脂質(zhì)過氧化、一氧化氮、炎癥細胞因子及細胞凋亡。因此保護腦神經(jīng)細胞結(jié)構(gòu)和功能,避免神經(jīng)元出現(xiàn)應(yīng)激損傷和凋亡,成為治療腦缺血再灌注損傷的關(guān)鍵。細胞凋亡是一種全程由基因控制的主動死亡,所以又稱程序性死亡(PCD)。從接收凋亡誘導(dǎo)因素到細胞凋亡大致分為三個階段,包括：凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)階段、凋亡基因的激活階段以及執(zhí)行階段,影響其中的任何一個階段都將中斷細胞凋亡的發(fā)生發(fā)展。線粒體作為細胞能量的代謝中心,是連接細胞應(yīng)激反應(yīng)和神經(jīng)元凋亡執(zhí)行的中心環(huán)節(jié),對各種損傷最為敏感,因此也是缺血性損害中的亞細胞靶點,其功能障礙可直接誘導(dǎo)細胞凋亡。一氧化氮合酶(nNOS)是一種鈣離子依賴酶,主要存在于神經(jīng)細胞內(nèi),正常情況下,其活性較低,僅產(chǎn)生生理劑量的NO起傳遞信號的作用。但有研究表明,缺血缺氧性腦損傷能激活nNOS產(chǎn)生過量的NO誘導(dǎo)Glutamate receptor 6 (GIuR6)亞硝基化,進而激活GluR6·PSD95·MLK3信號模式和c-Jun N-terminal kinase(JNK)信號通路以及凋亡信號調(diào)節(jié)激酶l(apoptosis signal-regulating kinase 1,ASK1)。而ASK1是對各種刺激起反應(yīng)的一種細胞死亡的總遞質(zhì),同時JNK通路也被認(rèn)為在腦缺血再灌注損傷過程中尤其是程序性細胞死亡過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。低氧誘導(dǎo)因子-la (Hypoxia-inducible factor-la, HIF-la)作為一種低氧敏感性轉(zhuǎn)錄因子,在缺血性中風(fēng)中與其下游的基因表達上調(diào)；同時有文獻報道,HIF-la被抑制,則蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠的海馬神經(jīng)元的凋亡增加并且認(rèn)知功能惡化。紅花是一種傳統(tǒng)中藥,屬菊科類一年生草本植物。其性溫味辛,歸心肝二經(jīng),目前在心血管及其他器官系統(tǒng)疾病治療方面已得到廣泛應(yīng)用。紅花黃色素(safflor yellow,SYP),亦稱為紅花黃素,是中藥紅花的主要活性成分之一,是近年來由紅花提取精制而成的靜脈制劑的主要成分,現(xiàn)代藥理藥效學(xué)研究發(fā)現(xiàn)其具有改善微循環(huán)、擴張冠脈血管、降血壓、抗氧化、免疫抑制以及保護心肌等多種藥理學(xué)功效。最近幾年有研究也報道紅花及其提取物紅花黃色素主要通過降低超氧化物歧化酶(MDA)濃度,增加丙二醛(SOD)活性,增強組織的抗氧化能力,從而減輕心、腦、肌肉、肺等多種組織器官的缺血再灌注損傷,而我們前期對脊髓缺血再灌注的研究結(jié)果也表明紅花注射液能很好的減輕脊髓缺血再灌注損傷,能減少脊髓前角神經(jīng)元的凋亡。陳鐸葆、張積青等學(xué)者在對大鼠缺血再灌注損傷的研究中也證實SYP具有腦保護作用,且認(rèn)為其可能與抑制腦組織內(nèi)Ca2+超載及興奮性氨基酸含量、從而抑制細胞凋亡有關(guān)。目的基于我們前期研究的關(guān)于控制性降壓不同水平對海馬CA1區(qū)的影響結(jié)果,發(fā)現(xiàn)將MAP降至基礎(chǔ)值的45%時,兔海馬CA1神經(jīng)元凋亡程度最嚴(yán)重,而SYP對兔較低CH水平誘導(dǎo)的缺血缺氧性腦損傷的影響及作用機制,目前少見報道。因此,本研究通過建立硝普鈉單純性控制性低血壓動物模型,觀察紅花黃色素對缺血缺氧性腦損傷后線粒體超微結(jié)構(gòu)的損傷程度以及缺血損傷相關(guān)蛋白(Caspase-3、nNOS和HIF-1α)表達的影響,探討低血壓狀態(tài)下SYP對兔腦海馬神經(jīng)元的保護作用以及可能的發(fā)生機制,為臨床研究提供理論依據(jù)。方法1.動物與分組：健康新西蘭白兔40只(雌雄各半,體重1.8-2.2Kg,由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供),隨機分為5組,每組8只。正常組(N組),控制性降壓組(即CH組,平均動脈壓[MAP]降至基礎(chǔ)值的45%組),SYP預(yù)處理組(SYP1組,控制性降壓基礎(chǔ)值45%前30min靜脈給予SYP,2m1/kg,用生理鹽水配制,含SYP 1.6mg/ml),SYP后處理組(SYP2組,控制性降壓基礎(chǔ)值45%開始后30min靜脈注射SYP,2ml/kg,用生理鹽水配制,含SYP1.6mg/ml),SYP預(yù)處理+后處理組(SYP1+SYP2組,控制性降壓基礎(chǔ)值45%開始前30min和開始后30min均給予靜脈注射SYP,2ml/kg,用生理鹽水配制,含SYP 1.6mg/ml)。2.模型制作：本研究沿用我們前期的實驗方法對新西蘭大白兔進行控制性降壓模型的制作,具體操作步驟如下：將禁飲禁食12h的實驗兔用水合氯醛腹腔注射麻醉后,在兔臺上固定頭與四肢。剃除頸前部兔毛,消毒,行氣管切開插氣管導(dǎo)管并接動物呼吸機機械通氣(潮氣量21 m1,呼吸51bpm,FiO21.0)。分離右側(cè)頸內(nèi)靜脈、穿刺置管,接延長管輸液通路并輸液。左側(cè)腹股溝四周剪毛,消毒,于腹股溝下緣靠內(nèi)測分離股動脈并穿刺置管,接測壓轉(zhuǎn)換器通路行平均動脈測壓。操作結(jié)束,無菌濕紗布覆蓋傷口,輸注適量乳酸鈉林格氏液,補充禁食喪失的液體總量約15ml/kg;將兔臺平放于39.5℃恒溫毯上保溫。待血壓穩(wěn)定15min后,記錄此刻基礎(chǔ)的平均動脈壓(MAP)、心率(HR)、中心靜脈壓(CVP)。正常組采用5%葡萄糖注射液4ml/(kg.h)連續(xù)泵注；降壓組及治療組均采用5%葡萄糖液配制的硝普鈉(400ug/ml)開始泵注,10～15分鐘內(nèi)降至目標(biāo)血壓,通過間斷的調(diào)節(jié)泵速,維持目標(biāo)血壓1 h。根據(jù)上述分組方案,在對應(yīng)的時間給予紅花黃色素。降壓期間所有動物的補液量(包括降壓藥物液體量),依據(jù)CVP調(diào)整,盡量減少補液量對血容量的影響。降壓完畢后,各實驗動物用乳酸鈉林格氏液4ml/(kg·h)泵速再灌注2 h后處死。取實驗動物海馬CA1區(qū)神經(jīng)元組織行病理學(xué)檢查,采用透射電鏡觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)改變,TUNEL法染色觀察腦組織標(biāo)本的細胞凋亡情況,使用免疫組化及Western blot檢測海馬組織中nNOS. HIF-1α、以及Caspase-3蛋白的表達。結(jié)果1.所有動物模型均制作成功,未出現(xiàn)因麻醉或手術(shù)意外的死亡。正常組死亡率為0,CH組死亡6只：2只死于降壓45min后,其余4只死于復(fù)壓開始后,死亡率75%；SYP1、SYP2、SYP1+SYP2組的動物分別死亡1只、2只、1只,均陸續(xù)死于復(fù)壓1h后,其死亡率均低于CH組,有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。2.透射電鏡下觀察海馬CA1區(qū)線粒體超微結(jié)構(gòu)及Flameng評分：N組細胞結(jié)構(gòu)完整,細胞器清晰可見,核仁染色質(zhì)均勻,未見核固縮碎裂或溶解；CH組可見超微結(jié)構(gòu)損傷較嚴(yán)重,可見核碎裂、溶解,細胞器結(jié)構(gòu)基本被破壞；SYP1組、SYP2組、SYP1+SYP2組損傷較CH組有所減輕,未見明顯的核碎裂及溶解,細胞間連接緊密：CH組線粒體Flameng評分較其他組均高(P0.05),其余各組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。3.TUNEL染色觀察凋亡細胞、計算凋亡指數(shù)：N組細胞結(jié)構(gòu)正常,可見極少量TUNEL陽性染色細胞；CH組陽性細胞數(shù)目顯著增多；紅花黃色素處理組(SYP1組、SYP2組、SYP1+SYP2組)TUNEL陽性染色細胞較CH組顯著減少(P0.05)；但SYP2組凋亡細胞數(shù)較其他兩組(SYP1組、SYP1+SYP2組)多,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)4.免疫組化和Western blot檢測海馬CA1區(qū)nNOS、HIF-1α、Caspase-3蛋白的表達：與N組相比,CH組nNOS、HIF-1α、Caspase-3表達顯著增加；紅花黃色素處理組(SYP1組、SYP2組、SYP1+SYP2組)較CH組表達下降,SYP2組與其他兩組比較各蛋白含量有所增加,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論1.通過形態(tài)學(xué)等研究證實紅花黃色素對控制性低血壓誘導(dǎo)的腦缺血再灌注損傷具有保護作用,在一定程度上可能降低其死亡率；2.在腦缺血再灌注損傷中,紅花黃色素起到保護作用可能與減少nNOS和HIF-la的含量有關(guān)；3.紅花黃色素通過抑制Caspase-3蛋白的表達,減少細胞的凋亡,從而抑制腦缺血再灌注損傷中神經(jīng)元的凋亡;4.不同給藥時間的紅花黃色素對缺氧性腦損傷均有保護作用,無明顯的時效關(guān)系。
【關(guān)鍵詞】：控制性降壓 缺血缺氧性腦損傷 紅花黃色素 保護作用 nNOS HIF-1α Caspase-3
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R741
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-17
• 第一章 引言17-22
• 第二章 實驗材料22-26
• 2.1 材料22-26
• 第三章 實驗方法26-34
• 3.1 實驗分組26
• 3.2 術(shù)前準(zhǔn)備26
• 3.3 麻醉及手術(shù)操作26-27
• 3.4 控制性低血壓模型的制作27-28
• 3.5 標(biāo)本采集與處理28
• 3.6 組織病理學(xué)觀察及指標(biāo)檢測28-33
• 3.7 統(tǒng)計學(xué)處理33-34
• 第四章 結(jié)果34-42
• 4.1 一般資料34
• 4.2 動物死亡率34-35
• 4.3 腦海馬CA1區(qū)神經(jīng)元透射電鏡觀察35-36
• 4.4 TUNEL染色檢測海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡36-38
• 4.5 腦海馬區(qū)nNOS、HIF-1α免疫組化結(jié)果38-40
• 4.6 海馬CA1區(qū)nNOS、HIF-1α、Caspase-3表達的Westeron blot檢測結(jié)果40-42
• 第五章 討論42-53
• 5.1 控制性降壓誘導(dǎo)的腦損傷模型的建立及相關(guān)評價42-43
• 5.2 腦缺血再灌注損傷發(fā)生的相關(guān)機制及防治研究43-46
• 5.3 紅花黃色素對控制性降壓誘導(dǎo)的缺血缺氧性腦損傷的影響46-49
• 5.4 紅花黃色素對海馬CA1區(qū)nNOS、HIF-1α的影響49-51
• 5.5 紅花黃色素對海馬CA1區(qū)Caspase-3蛋白表達的影響51-53
• 第六章 結(jié)論53-54
• 第七章 不足與展望54-55
• 參考文獻55-63
• 文獻綜述63-69
• 參考文獻66-69
• 讀研期間研究成果69-70
• 致謝70-71

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