本文關(guān)鍵詞：基于風(fēng)險(xiǎn)決策的眼刺激性評(píng)價(jià)組合替代方法的研究

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【摘要】：研究背景及目的 化學(xué)物質(zhì)引起的局部眼刺激作用，通常涉及結(jié)膜、角膜、虹膜和淚腺的刺激效應(yīng)，以角膜的刺激作用為首，其次是結(jié)膜、虹膜。傳統(tǒng)的眼刺激作用，采用動(dòng)物試驗(yàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)，鑒于其備受質(zhì)疑的合理性和倫理性，此法已不能滿足當(dāng)前產(chǎn)品風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和法規(guī)管理的需要。基于體內(nèi)眼刺激作用發(fā)生的機(jī)制，目前已開(kāi)發(fā)了多種替代動(dòng)物試驗(yàn)的方法。單一體外方法可較好地模擬復(fù)雜眼損傷作用中的某個(gè)方面，但如何組合使用，以滿足實(shí)際工作需要，尚有待深入研究。因此，有必要根據(jù)角膜損傷的發(fā)生機(jī)制，結(jié)合體外方法的原理和標(biāo)準(zhǔn)化應(yīng)用程度，對(duì)目前眼刺激實(shí)驗(yàn)的諸多替代方法的科學(xué)性和適用性進(jìn)行評(píng)估。在此基礎(chǔ)上，根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康�，建立成組的體外方法策略，以完全取代動(dòng)物測(cè)試，滿足風(fēng)險(xiǎn)決策和安全評(píng)價(jià)的需要。 本研究建立雞胚尿囊膜絨毛膜苔盼藍(lán)染色實(shí)驗(yàn)（Chicken ChorioallantoicMembrane-Trypan Blue Staining，CAM-TBS）、紅細(xì)胞溶血實(shí)驗(yàn)（Red blood cellhaemolysis test，RBC）和SIRC細(xì)胞短時(shí)暴露實(shí)驗(yàn)（Short-term exposure，STE）三種眼刺激實(shí)驗(yàn)替代方法，并評(píng)估其單獨(dú)或組合用于風(fēng)險(xiǎn)決策系統(tǒng)的科學(xué)性和局限性。為下一步建立眼刺激實(shí)驗(yàn)體外替代方法的組合模式提供支持。以滿足替代動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的法規(guī)要求，也為產(chǎn)品安全性評(píng)價(jià)的風(fēng)險(xiǎn)決策提供資料。是今后推動(dòng)我國(guó)眼刺激評(píng)價(jià)的體外標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)方法的鋪墊。 研究方法 1雞胚尿囊絨毛膜苔盼藍(lán)染色實(shí)驗(yàn)（CAM-TBS） 該實(shí)驗(yàn)利用雞胚絨毛膜尿囊膜結(jié)構(gòu)與人結(jié)膜相似的特點(diǎn)，在定性觀察的基礎(chǔ)上，建立定量檢測(cè)的方法。通過(guò)觀察化合物作用于CAM引發(fā)出血、血管溶解和凝血反應(yīng)的損傷程度，并測(cè)定CAM吸收臺(tái)盼藍(lán)的量，從而定量檢測(cè)受試物損傷作用，提高了實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性。 2紅細(xì)胞溶血實(shí)驗(yàn)（RBC） 通常具有眼刺激作用的物質(zhì)也能使蛋白質(zhì)變性或細(xì)胞膜溶解。將化合物直接接觸哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞，通過(guò)定量檢測(cè)紅細(xì)胞溶血，以及釋放出細(xì)胞外的血紅蛋白變性程度，模擬類似角膜的損傷作用。 3SIRC細(xì)胞短時(shí)暴露實(shí)驗(yàn)（STE） 化合物直接作用于角膜引起的刺激作用類似于細(xì)胞毒性損傷作用。通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞毒性指標(biāo)，可反應(yīng)角膜損傷的程度。實(shí)驗(yàn)采用體外培養(yǎng)的兔角膜細(xì)胞（SIRC），短期暴露細(xì)胞于化合物，模擬急性角膜刺激作用，計(jì)算細(xì)胞活性、生長(zhǎng)的抑制程度，及其與化學(xué)物的濃度-效應(yīng)關(guān)系。 4提出替代方法的組合策略 基于危害物質(zhì)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的基本理論與原則，在參考國(guó)內(nèi)外眼刺激試驗(yàn)最新法規(guī)認(rèn)可與標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)展的基礎(chǔ)上，提出以三種替代方法為主體的眼刺激試驗(yàn)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估組合策略。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1雞胚尿囊絨毛膜苔盼藍(lán)染色實(shí)驗(yàn)（CAM-TBS）苔盼藍(lán)濃度與吸光度OD值間存在正相關(guān)，回歸模型表達(dá)式為y=0.2968+0.0004x 回歸系數(shù)的區(qū)間估計(jì)：95%CI=[0.0002，0.0005]。R2=0.8994，表明利用苔盼藍(lán)濃度變量可以解釋吸光度OD值變異情況的89.94%。 2紅細(xì)胞溶血實(shí)驗(yàn)（RBC） 對(duì)RBC實(shí)驗(yàn)與Draize實(shí)驗(yàn)的受試物分類做配對(duì)資料的Wilcoxon符號(hào)秩和檢驗(yàn)，得S=1.8182，p=0.9976，在檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05的水平下，兩者之間的差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。經(jīng)一致性檢驗(yàn)，得出Kappa=0.6356，置信區(qū)間為[0.3930,0.8781]；RBC實(shí)驗(yàn)和Draize兔眼實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一致性較好。 3SIRC細(xì)胞短時(shí)暴露實(shí)驗(yàn)（STE） SIRC細(xì)胞短時(shí)暴露實(shí)驗(yàn)（STE）所分的結(jié)果，與Draize兔眼實(shí)驗(yàn)分類結(jié)果相比較，經(jīng)過(guò)kappa一致性檢驗(yàn)，kappa值=0.6316，95%可信區(qū)間為[0.4040,0.8592]，兩種分類一致性較好。 4替代方法組合試驗(yàn)策略 本組合適用于無(wú)刺激性到嚴(yán)重刺激性范圍內(nèi)眼刺激危害性的評(píng)價(jià)，對(duì)于無(wú)刺激性到中等刺激性的區(qū)分優(yōu)勢(shì)明顯，三種方法組合流程見(jiàn)下圖。 根據(jù)受試物的理化特性，預(yù)期為有刺激性的物質(zhì)先進(jìn)行CAM-TBS測(cè)試，若測(cè)試結(jié)果為嚴(yán)重刺激性，則可直接分類為嚴(yán)重刺激性；若測(cè)試結(jié)果為非嚴(yán)重刺激性，則進(jìn)行細(xì)胞短期暴露測(cè)試或紅細(xì)胞溶血試驗(yàn)，若為表面活性劑或含表面活性劑配方，則進(jìn)行紅細(xì)胞溶血試驗(yàn)，其它物質(zhì)則選擇細(xì)胞短期暴露試驗(yàn)，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果可對(duì)受試物眼刺激性分類。 預(yù)期為無(wú)刺激性的物質(zhì)，若為可溶性物質(zhì)或配方，，先進(jìn)行細(xì)胞短期暴露測(cè)試，若測(cè)試結(jié)果為無(wú)刺激性，則可直接分類為無(wú)刺激性；若為表面活性劑或含表面活性劑配方，則需要補(bǔ)充紅細(xì)胞溶血試驗(yàn)加以確認(rèn)或直接用此法進(jìn)行測(cè)試。若結(jié)果有刺激性，則進(jìn)行CAM-TBS測(cè)試，確認(rèn)并區(qū)分刺激的嚴(yán)重程度。 結(jié)論 本研究選擇CAM-TBS、RBC和STE三種眼刺激實(shí)驗(yàn)替代方法，模擬結(jié)膜和角膜受損的機(jī)制，在改進(jìn)試驗(yàn)材料和試驗(yàn)方案的基礎(chǔ)上，探索建立替代實(shí)驗(yàn)組合。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Draize兔眼實(shí)驗(yàn)結(jié)果相比，這三種方法的體內(nèi)相關(guān)性、分級(jí)一致性和結(jié)果重現(xiàn)性均良好。 三種方法均可定量檢測(cè)化合物的眼刺激性。并且三者適用于不同的化合物，化合物的眼刺激性分類范圍也不同。對(duì)于嚴(yán)重刺激性物質(zhì)，CAM-TBS實(shí)驗(yàn)分類較好；中等/溫和刺激性物質(zhì)分類，RBC實(shí)驗(yàn)分類較好；弱/無(wú)刺激性物質(zhì)分類，STE實(shí)驗(yàn)分類較好。CAM-TBS實(shí)驗(yàn)可用于測(cè)試單一化合物或混合物，該方法不適合用于有色嚴(yán)重刺激性物質(zhì)的分類。RBC實(shí)驗(yàn)與STE實(shí)驗(yàn)適用于可溶解性物質(zhì)的檢測(cè)，但不適用于難溶物質(zhì)或混合物的測(cè)試，且前者對(duì)表面活性劑更敏感。 綜合考慮三種方法的優(yōu)點(diǎn)和局限性，初步提出組合使用結(jié)論：CAM-TBS實(shí)驗(yàn)與RBC實(shí)驗(yàn)組合對(duì)嚴(yán)重刺激性物質(zhì)分類較準(zhǔn)確；CAM-TBS實(shí)驗(yàn)與STE實(shí)驗(yàn)組合分類對(duì)無(wú)刺激到中等刺激性物質(zhì)分類相對(duì)一致性高；RBC實(shí)驗(yàn)與STE實(shí)驗(yàn)組合適用于弱/無(wú)刺激性可溶解性物質(zhì)的分類。
【關(guān)鍵詞】：風(fēng)險(xiǎn)決策 眼刺激實(shí)驗(yàn) 替代實(shí)驗(yàn)組合
【學(xué)位授予單位】：廣東藥學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R77;R181.3
【目錄】：

• 中文摘要6-10
• ABSTRACT10-15
• 前言15-21
• 1 眼刺激的風(fēng)險(xiǎn)來(lái)源及法規(guī)管理15-16
• 1.1 眼刺激的風(fēng)險(xiǎn)來(lái)源15
• 1.2 眼刺激性的法規(guī)管理15-16
• 1.3 國(guó)際貿(mào)易法規(guī)對(duì)眼刺激試驗(yàn)的影響16
• 2 眼刺激的替代試驗(yàn)16-18
• 2.1 眼刺激動(dòng)物試驗(yàn)的局限17
• 2.2 替代方法的科學(xué)依據(jù)17-18
• 3 替代方法研究進(jìn)展18-19
• 4 基于風(fēng)險(xiǎn)決策的眼刺激組合模式研究19-21
• 4.1 眼刺激風(fēng)險(xiǎn)決策程序的變化19
• 4.2 替代方法的組合19-21
• 一、材料與方法21-40
• 1 材料21-24
• 1.1 已知刺激性化合物21-22
• 1.2 儀器及耗材22-23
• 1.3 常用試劑23-24
• 1.4 常用溶液及其配方24
• 2 方法24-40
• 2.1 雞胚尿囊膜絨毛膜苔盼藍(lán)染色實(shí)驗(yàn)24-27
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備24-25
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)步驟25-26
• 2.1.3 參數(shù)指標(biāo)26
• 2.1.4 計(jì)算公式26
• 2.1.5 統(tǒng)計(jì)方法26-27
• 2.2 紅細(xì)胞溶血實(shí)驗(yàn)27-30
• 2.2.1 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備27-29
• 2.2.2 實(shí)驗(yàn)步驟29
• 2.2.3 參數(shù)指標(biāo)29-30
• 2.2.4 計(jì)算公式30
• 2.2.5 統(tǒng)計(jì)方法30
• 2.3 SIRC 細(xì)胞短時(shí)暴露實(shí)驗(yàn)30-36
• 2.3.1 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備31-35
• 2.3.2 實(shí)驗(yàn)步驟35-36
• 2.3.3 參數(shù)指標(biāo)36
• 2.3.4 計(jì)算公式36
• 2.3.5 統(tǒng)計(jì)方法36
• 2.4 Draize 兔眼實(shí)驗(yàn)36-40
• 2.4.1 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備37
• 2.4.2 實(shí)驗(yàn)步驟37
• 2.4.3 觀察與評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)37-38
• 2.4.4 結(jié)果評(píng)價(jià)38-40
• 二、結(jié)果40-48
• 1 雞胚尿囊膜絨毛膜苔盼藍(lán)染色實(shí)驗(yàn)（CAM-TBS）40-43
• 1.1 苔盼藍(lán)濃度與吸光度 OD 值之間的關(guān)系40-41
• 1.1.1 Pearson 相關(guān)分析40
• 1.1.2 回歸分析40-41
• 1.2 單位膜重量吸收苔盼藍(lán)的量（nmol/mg）41-43
• 1.3 Kappa 一致性檢驗(yàn)43
• 2 紅細(xì)胞溶血實(shí)驗(yàn)（RBC）43-44
• 2.1 化合物與紅細(xì)胞懸液作用的體積比43
• 2.2 測(cè)量吸光度 OD 值選用的波長(zhǎng)43-44
• 2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理44
• 3 SIRC 細(xì)胞短時(shí)暴露實(shí)驗(yàn)（STE）44-46
• 4 DRAIZE 兔眼實(shí)驗(yàn)46
• 5 三種方法一致性的比較46-47
• 6 替代方法組合試驗(yàn)策略47-48
• 三、討論48-53
• 1 眼刺激體外方法的研究48-49
• 2 眼刺激性的風(fēng)險(xiǎn)決策49-51
• 2.1 眼刺激風(fēng)險(xiǎn)決策的考慮因素49
• 2.2 眼刺激風(fēng)險(xiǎn)的決策樹(shù)49-51
• 3 替代方法的分層組合策略51-53
• 3.1 組合策略中體外方法選擇原則51
• 3.2 替代方法的分類51-52
• 3.3 三種替代方法的組合52-53
• 四、結(jié)論53-54
• 參考文獻(xiàn)54-58
• 綜述58-66
• 參考文獻(xiàn)64-66
• 讀研期間發(fā)表（撰寫(xiě)）的論文及申請(qǐng)的專利66-67
• 附錄（英文縮略詞表）67-68
• 致謝68

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前5條

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本文編號(hào)：981509