本文關鍵詞：淡色庫蚊酚氧化酶proPOA3基因克隆及其與溴氰菊酯抗性關系的研究

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【摘要】：蚊可傳播瘧疾、登革等多種疾病(蚊媒病),嚴重危害人類健康。化學防制一直是蚊媒綜合治理的主要方法。殺蟲劑大量、持續(xù)使用導致了蚊抗藥性的發(fā)生和發(fā)展。目前,殺蟲劑抗性已成為蚊媒病防制工作的最大障礙�？顾幮允怯苫驔Q定的,發(fā)現和研究蚊媒殺蟲劑抗性相關基因及其作用機制,有助于闡明抗藥性的分子基礎和治理抗藥性。 本實驗前期研究從淡色庫蚊(Culex pipiens pallens)溴氰菊酯敏感和抗性品系中分離、鑒定出多個表達差異序列,其中包括酚氧化酶原亞單位A3(prophenoloxidase subunit A3,proPOA3).在此基礎上,本研究采用RT-PCR以及cDNA末端快速擴增(rapid amplification o f cDNA end,RACE)技術擴增淡色庫蚊proPOA3基因；在細胞水平通過轉染方法,研究proPOA3高表達對蚊細胞溴氰菊酯敏感性的影響；隨后通過實時定量PCR法鑒定了proPOA3基因在溴氰菊酯不同抗性水平蚊中的差異表達;最后應用PCR、基因序列分析等方法研究proPOA3基因點突變與溴氰菊酯表型的關系。 本研究的主要結果如下： 本研究獲得的淡色庫蚊proPOA3全長序列共2349bp,開放閱讀框(open reading frame,ORF)為2061bp,編碼686個氨基酸(GeneBank登錄號：FJ755838.1,2009)。序列分析顯示,該基因在物種中保守性較高,推導的氨基酸序列與已報道致倦庫蚊(Cx.quinquefasciatus)的proPOA3具有98%同源性,并具有經典的酚氧化酶含銅中心結構,表明該基因為淡色庫蚊proPOA3. 構建淡色庫蚊proPOA3昆蟲表達載體并轉染蚊細胞,CCK-8檢測發(fā)現,在高濃度溴氰菊酯(101.5μg/ml和102.0μg/ml)作用下,proPOA3轉染組的存活率低于對照組(p0.05),即高表達proPOA3后蚊細胞對溴氰菊酯的敏感性增強,提示proPOA3基因可能參與溴氰菊酯抗性的形成,為1個新的蚊抗藥性相關基因。 實時定量PCR結果顯示,淡色庫蚊proPOA3基因在無錫、南京、唐口和禹城4地現場自然種群溴氰菊酯敏感組中均高表達,分別為抗性組的2.60倍、6.33倍、4.33倍和5.02倍(均p0.05)。對其它蚊種現場自然種群的進一步分析表明,proPOA3在三帶喙庫蚊(Cx.tritaeniorhynchus)溴氰菊酯敏感組中是抗性組的5.03倍(p0.05),但在中華按蚊(A nopheles. sinensis)和微小按蚊(An. minimus)的敏感組、抗性組之間無顯著性差異(均p0.05)。此外,在實驗室淡色庫蚊溴氰菊酯逐代篩選試驗中,發(fā)現proPOA3的轉錄水平隨著溴氰菊酯抗性水平(LCso)的增加而降低,兩者具有顯著負相關性(p0.05)。本結果進一步驗證proPOA3基因的表達與庫蚊溴氰菊酯抗性負相關,提示該基因可望作為庫蚊擬除蟲菊酯抗性現場檢測的分子靶標,值得進一步研究。 對proPOA3的基因型分析提示,淡色庫蚊存在2個突變位點、3種突變型(769GA、1116GC和1116GA)。769GA屬于非同義突變(non-synonymous mutation),導致纈氨酸突變?yōu)楫惲涟彼幔?116GC和1116GA屬于同義突變(synonymous mutation),相應位置氨基酸未發(fā)生變化。其中,769GA和1116GC突變是同時出現的,當769位堿基發(fā)生純合突變(G/G→A/A)時,1116位堿基也為純合突變(G/G→C/C)；當769位堿基為雜合突變(G/G→G/A)時,1116位堿基也為雜合突變(G/G→G/C)。青島、微山、南京、無錫和淮北5地自然種群淡色庫蚊經生物測定后,分別檢測上述突變在敏感品系和抗性品系中的頻率。769GA(1116GC)突變在抗性品系中的頻率分別為：42.86%(青島)、11.54%(微山)和23.92%(南京),均顯著高于敏感品系：5.56%(青島)、0%(微山)和0%(南京),該突變在無錫和淮北敏感、抗性品系中卻均未被檢測出。1116GA突變只在無錫自然種群中被檢測出,其中抗性種群為13.64%,敏感種群為9.52%,無顯著性差異(p0.05)。淮北自然種群未檢測出上述3種突變。在實驗室溴氰菊酯逐代篩選蚊實驗中,發(fā)現769GA(1116GC)突變頻率隨著溴氰菊酯劑量增加呈規(guī)律性增加趨勢,兩者具有顯著正相關性(p0.05)；而1116GA突變在第14代檢測時則已消失。以上實驗結果提示,在溴氰菊酯抗性的發(fā)生、發(fā)展過程中,769GA(1116GC)突變可能具有重要作用,而1116GA突變可能與溴氰菊酯抗性不相關或不直接相關,均有待進一步研究。 本研究首次報告了淡色庫蚊proPOA3全長序列,發(fā)現proPOA3為1個新的蚊抗藥性相關基因,存在2個突變位點、3種突變型,研究結果為闡明抗藥性分子機理和治理抗藥性提供了科學依據,具有重要的理論意義和潛在的實際應用價值。
【關鍵詞】：淡色庫蚊 溴氰菊酯 殺蟲劑抗性 酚氧化酶 基因突變
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R184
【目錄】：

• 中文摘要8-11
• ABSTRACT11-14
• 前言14-17
• 第一部分 淡色庫蚊proPOA3基因克隆與鑒定17-36
• 材料與方法17-28
• 1 材料17-18
• 1.1 供試蚊17
• 1.2 主要試劑17-18
• 1.3 主要儀器18
• 2 方法18-28
• 2.1 淡色庫蚊proPOA3克隆18-27
• 2.2 生物信息學分析27-28
• 結果28-34
• 1 淡色庫蚊proPOA3克隆28-30
• 1.1 淡色庫蚊RNA的提取及鑒定28
• 1.2 淡色庫蚊proPOA3基因ORF序列擴增28-29
• 1.3 淡色庫蚊proPOA3基因5’端以及3’端序序列擴增29-30
• 1.4 淡色庫蚊proPOA3基因全長序列拼接30
• 2 淡色庫蚊proPOA3基因生物信息學分析30-34
• 2.1 淡色庫蚊proPOA3基因序列分析30
• 2.2 淡色庫蚊proPOA3基因同源性分析30-33
• 2.3 淡色庫蚊proPOA3基因進化樹分析33
• 2.4 淡色庫蚊proPOA3基因編碼蛋白結構域分析33-34
• 討論34-36
• 第二部分 淡色庫蚊proPOA3基因高表達對蚊細胞溴氰菊酯敏感性的影響36-55
• 材料與方法36-49
• 1 材料36-37
• 1.1 供試蚊及細胞系36-37
• 1.2 主要試劑37
• 1.3 主要儀器37
• 2 方法37-49
• 2.1 淡色庫蚊proPOA3昆蟲表達載體構建38-41
• 2.2 淡色庫蚊proPOA3瞬時轉染對蚊細胞溴氰菊酯敏感性測定41-43
• 2.3 瞬時轉染效率鑒定43-49
• 結果49-52
• 1 淡色庫蚊proPOA3昆蟲表達載體構建49-50
• 2 ProPOA3瞬時轉染鑒定50-51
• 2.1 RT-PCR鑒定50
• 2.2 Western blot鑒定50-51
• 3 淡色庫蚊proPOA3 高表達后蚊細胞對溴氰菊酯敏感性的變化51-52
• 討論52-55
• 第三部分 ProPOA3在溴氰菊酯不同抗性水平蚊種群中的表達分析材料與方法55-67
• 材料與方法55-61
• 1 材料55-56
• 1.1 供試蚊55-56
• 1.2 主要試劑56
• 1.3 主要儀器56
• 2 方法56-61
• 2.1 淡色庫蚊現場自然種群proPOA3的表達分析56-58
• 2.2 三帶喙庫蚊、中華按蚊和微小按蚊現場自然種群proPOA3的表達分析58-59
• 2.3 淡色庫蚊溴氰菊酯逐代篩選種群proPOA3的表達分析59-61
• 結果61-65
• 1 ProPOA3在淡色庫蚊自然種群敏感、抗性組中的表達差異61
• 2 ProPOA3在不同蚊種自然種群敏感、抗性組中的表達差異61-62
• 3 ProPOA3 在淡色庫蚊溴氰菊酯逐代篩選種群中的表達差異62-65
• 3.1 淡色庫蚊溴氰菊酯逐代篩選種群的實驗室選育62
• 3.2 ProPOA3在淡色庫蚊溴氰菊酯逐代篩選種群中的表達變化62-65
• 討論65-67
• 第四部分 ProPOA3在溴氰菊酯不同抗性水平蚊種群中的基因多態(tài)性分析67-78
• 材料與方法67-71
• 1 材料67-68
• 1.1 供試蚊67-68
• 1.2 主要試劑68
• 1.3 主要儀器68
• 2 方法68-71
• 2.1 淡色庫蚊自然種群proPOA3基因的多態(tài)性分析68-70
• 2.2 淡色庫蚊溴氰菊酯逐代篩選種群proPOA3基因的多態(tài)性分析70-71
• 結果71-75
• 1 淡色庫蚊自然種群proPOA3基因多態(tài)性檢測71-72
• 1.1 單蚊基因組DNA提取71
• 1.2 淡色庫蚊自然種群proPOA3基因多態(tài)性71-72
• 2 淡色庫蚊溴氰菊酯逐代篩選種群proPOA3基因多態(tài)性檢測72-75
• 2.1 單蚊基因組DNA提取72
• 2.2 淡色庫蚊溴氰菊酯逐代篩選種群proPOA3基因多態(tài)性變化72-75
• 討論75-78
• 參考文獻78-89
• 綜述89-103
• 參考文獻98-103
• 攻讀學位期間發(fā)表文章情況103-104
• 致謝104

【參考文獻】

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本文編號：900870