本文關(guān)鍵詞：吉林省扶余市華支睪吸蟲(chóng)感染的分子流行病學(xué)研究

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【摘要】：華支睪吸蟲(chóng)病(Clonorchiasis)又稱(chēng)為肝吸蟲(chóng)病,是由華支睪吸蟲(chóng)(Clonorchis sinensis)寄生于人和哺乳動(dòng)物肝膽管內(nèi)引起的一種嚴(yán)重的食源性人獸共患寄生蟲(chóng)病。當(dāng)人們因生食或半生食含有活的華支睪吸蟲(chóng)囊蚴的魚(yú)蝦后,即可感染,并在人體內(nèi)發(fā)育為成蟲(chóng)并排卵。華支睪吸蟲(chóng)主要分布于東亞及東南亞地區(qū),全球大概有三千多萬(wàn)人感染,其中僅中國(guó)感染人數(shù)就占了一半左右,是深受華支睪吸蟲(chóng)危害的國(guó)家之一。吉林省是我國(guó)華支睪吸蟲(chóng)感染的高發(fā)區(qū)域,其中扶余市是沿松花江流域的重災(zāi)區(qū)之一,對(duì)該地區(qū)進(jìn)行華支睪吸蟲(chóng)病的流行病學(xué)調(diào)查勢(shì)在必行。同時(shí)為明確物種基因型,對(duì)該地區(qū)的華支睪吸蟲(chóng)種株進(jìn)行分子生物學(xué)分析,這對(duì)于了解物種的特異性有重大意義,同時(shí)建立分子生物學(xué)診斷方法,為臨床診斷及防治提供了重要的分子生物學(xué)信息和方法。因此我們展開(kāi)了對(duì)扶余市華支睪吸蟲(chóng)感染的分子流行病學(xué)研究。(1)扶余市沿江流域的流行病學(xué)調(diào)查我們對(duì)當(dāng)?shù)氐娜齻�(gè)鎮(zhèn)子的14個(gè)村子,2142名村民進(jìn)行了問(wèn)卷調(diào)查,共收集到糞便樣本1745份。利用改良加藤厚涂片對(duì)糞便樣本進(jìn)行初步篩查,共得到含有蟲(chóng)卵的陽(yáng)性糞便樣本513份。同時(shí)獲得513份血清,最后通過(guò)實(shí)驗(yàn)室篩選后為實(shí)驗(yàn)室診斷試劑盒的研制提供陽(yáng)性血清標(biāo)本。對(duì)調(diào)查問(wèn)卷中的相關(guān)數(shù)據(jù)(性別、年齡、生食魚(yú)蝦習(xí)慣、飲酒)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,結(jié)果顯示,男女感染比例分別是36.2%和21.3%,差異顯著(P0.01);患病率較高的年齡段集中在40-59歲;生食魚(yú)蝦習(xí)慣和飲酒習(xí)慣對(duì)于感染比率也存在顯著差異(P0.01,OR分別是3.211,1.97)。為進(jìn)一步了解華支睪吸蟲(chóng)感染后可造成肝膽管的增粗、管壁增厚等影像學(xué)變化,我們對(duì)之前的513個(gè)陽(yáng)性人群進(jìn)行了肝膽胰脾的超聲檢查,結(jié)果顯示其中18%的人的超聲檢查表現(xiàn)為肝內(nèi)小膽管彌漫性的擴(kuò)張和肝內(nèi)膽管壁的增厚,2.5%表現(xiàn)為膽囊內(nèi)不連續(xù)的梭形浮動(dòng)的回聲或膽囊結(jié)石表現(xiàn)。同時(shí),我們對(duì)當(dāng)?shù)丨h(huán)境及三個(gè)鎮(zhèn)子市售的10種淡水魚(yú)和蝦進(jìn)行了囊蚴檢測(cè),發(fā)現(xiàn)其中麥穗魚(yú)、白魚(yú)、船丁魚(yú)的囊蚴感染率較高。通過(guò)流行病學(xué)的調(diào)查得到的結(jié)論是:1)改良加藤厚涂片法仍是規(guī)模性華支睪吸蟲(chóng)病現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的快速手段;2)生食魚(yú)蝦的習(xí)慣是感染華支睪吸蟲(chóng)的重要途徑,同時(shí)男性、高年齡及飲酒習(xí)慣都影響感染率的危險(xiǎn)因素;3)超聲檢查可作為華支睪吸蟲(chóng)病診斷的便捷的輔助檢查方法;4)改善衛(wèi)生環(huán)境及不良的飲食習(xí)慣是控制該病的根本措施。(2)華支睪吸蟲(chóng)的特異性引物設(shè)計(jì)及篩選在對(duì)當(dāng)?shù)氐氖惺埕~(yú)進(jìn)行囊蚴檢測(cè)的過(guò)程中,我們?cè)隰~(yú)體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了形態(tài)似華支睪吸蟲(chóng)囊蚴和東方次睪吸蟲(chóng)的囊蚴。為從分子水平明確物種,也為后續(xù)的蟲(chóng)卵物種鑒定奠定基礎(chǔ),我們利用Gen Bank中的序列,通過(guò)對(duì)比,尋找特異性的保守區(qū),從而設(shè)計(jì)出幾對(duì)引物并進(jìn)行篩選。利用普通PCR和多重PCR對(duì)引物進(jìn)行篩選。結(jié)果尋找到Cs F2R3作為華支睪吸蟲(chóng)的特異性引物和Mo F2R2作為東方次睪吸蟲(chóng)特異性引物,測(cè)序結(jié)果顯示兩對(duì)引物擴(kuò)增的序列分別與所鑒定物種具有高度同源性。(3)華支睪吸蟲(chóng)病的分子生物學(xué)診斷方法的建立和優(yōu)化利用已經(jīng)篩選出來(lái)的華支睪吸蟲(chóng)的特異性引物,建立PCR反應(yīng)體系,并對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化,包括引物、模板濃度及反應(yīng)時(shí)間等,從而獲得最佳反應(yīng)體系及反應(yīng)條件,目的是為增加診斷的靈敏度,從而為后續(xù)的糞便蟲(chóng)卵DNA的基因擴(kuò)增提供技術(shù)支持。通過(guò)反復(fù)的探索,最終我們成功建立了以華支睪吸蟲(chóng)DNA為模板的基因診斷方法。(4)扶余市松花江流域華支睪吸蟲(chóng)的蟲(chóng)種鑒定及核酸序列分析為了解扶余市松花江流域華支睪吸蟲(chóng)的基因型,利用已經(jīng)篩選到的華支睪吸蟲(chóng)和東方次睪吸蟲(chóng)特異性引物對(duì)糞便中的蟲(chóng)卵DNA進(jìn)行多重PCR,從而鑒定蟲(chóng)種及獲得基因序列。結(jié)果顯示513個(gè)蟲(chóng)卵陽(yáng)性的糞便樣本中均未發(fā)現(xiàn)東方次睪吸蟲(chóng)的感染,其中的265(51.7%)個(gè)樣本顯示為華支睪吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵。通過(guò)BLAST對(duì)所獲得的序列進(jìn)行比對(duì),結(jié)果顯示與華支睪吸蟲(chóng)ITS2注冊(cè)序列中的AF217099和AF217094同源性可達(dá)到99-100%。結(jié)論:PCR的方法是診斷華支睪吸蟲(chóng)病非常有效的確診手段,雖操作相對(duì)繁瑣,卻增加了華支睪吸蟲(chóng)病診斷的精確性,減少了誤診率,可作為確診手段;通過(guò)PCR的方法我們篩選出了標(biāo)準(zhǔn)的華支睪吸蟲(chóng)病患者的陽(yáng)性血清,為診斷性試劑盒的研制提供了重要的標(biāo)本支持。
【關(guān)鍵詞】：華支睪吸蟲(chóng) 分子流行病學(xué) 囊蚴 診斷
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R532.23;R181.3
【目錄】：

• 前言4-5
• 中文摘要5-7
• Abstract7-13
• 中英文縮略詞對(duì)照表13-14
• 第1章 緒論14-28
• 1.1 引言14
• 1.2 文獻(xiàn)綜述14-26
• 1.2.1 華支睪吸蟲(chóng)及華支睪吸蟲(chóng)病14-16
• 1.2.2 華支睪吸蟲(chóng)病的病理生理及臨床表現(xiàn)16-18
• 1.2.3 華支睪吸蟲(chóng)病的流行病學(xué)概況18-19
• 1.2.4 華支睪吸蟲(chóng)病的診斷方法的研究進(jìn)展19-22
• 1.2.5 華支睪吸蟲(chóng)病的防治22-24
• 1.2.6 華支睪吸蟲(chóng)感染與CCA關(guān)系24-25
• 1.2.7 研究熱點(diǎn)25-26
• 1.3 研究思路26-28
• 第2章 扶余市人群華支睪吸蟲(chóng)感染的流行病學(xué)調(diào)查28-40
• 2.1 研究對(duì)象及樣本采集28
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料28-29
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法29
• 2.3.1 問(wèn)卷調(diào)查29
• 2.3.2 制作鏡檢加藤片29
• 2.3.3 顯微鏡下查找蟲(chóng)卵及蟲(chóng)卵計(jì)數(shù)29
• 2.3.4 腹部超聲檢查29
• 2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果29-36
• 2.4.1 統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果29-32
• 2.4.2 糞樣中蟲(chóng)卵及蟲(chóng)卵計(jì)數(shù)32-33
• 2.4.3 超聲影像33-36
• 2.5 討論36-40
• 第3章 扶余市淡水魚(yú)的華支睪吸蟲(chóng)感染情況調(diào)查40-52
• 3.1 扶余市淡水魚(yú)養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境調(diào)查40-42
• 3.1.1 扶余市地理位置40-41
• 3.1.2 淡水魚(yú)養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境調(diào)查41-42
• 3.2 市售淡水魚(yú)的感染情況調(diào)查42-49
• 3.2.1 研究對(duì)象和樣本收集42
• 3.2.2 實(shí)驗(yàn)材料42-43
• 3.2.3 實(shí)驗(yàn)方法43-46
• 3.2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果46-49
• 3.3 討論49-52
• 第4章 華支睪吸蟲(chóng)特異性引物的設(shè)計(jì)及篩選52-62
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料52
• 4.1.1 儀器52
• 4.1.2 試劑52
• 4.1.3 試劑配制52
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法52-55
• 4.2.1 引物設(shè)計(jì)52-54
• 4.2.2 引物篩選54-55
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果55-60
• 4.3.1 Cs DNA標(biāo)準(zhǔn)品的鑒定結(jié)果55-56
• 4.3.2 Mo DNA標(biāo)準(zhǔn)品的鑒定結(jié)果56
• 4.3.3 梯度PCR篩選結(jié)果56-60
• 4.4 討論60-62
• 第5章 華支睪吸蟲(chóng)病的分子生物學(xué)診斷62-70
• 5.1 實(shí)驗(yàn)材料62-63
• 5.1.1 儀器62
• 5.1.2 試劑62-63
• 5.2 實(shí)驗(yàn)方法63-66
• 5.2.1 收集蟲(chóng)卵63
• 5.2.2 提取蟲(chóng)卵DNA63-64
• 5.2.3 多重PCR擴(kuò)增及測(cè)序64-66
• 5.2.4 重復(fù)PCR66
• 5.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果66-67
• 5.3.1 糞便蟲(chóng)卵多重PCR鑒定結(jié)果66-67
• 5.3.2 重復(fù)PCR鑒定67
• 5.3.3 基因序列比對(duì)結(jié)果67
• 5.4 討論67-70
• 第6章 結(jié)論70-72
• 參考文獻(xiàn)72-88
• 作者簡(jiǎn)介及在學(xué)期間所取得的科研成果88-90
• 致謝90

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8 鐘睿，

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