發(fā)布時間：2017-09-09 16:35

  本文關(guān)鍵詞：云南省GBV-C流行與進化特征及其自身清除機制的研究

  更多相關(guān)文章： 庚型肝炎病毒 靜脈吸毒人群 云南省 起源與進化 microRNA

【摘要】：庚型肝炎病毒(GB virus C, GBV-C)發(fā)現(xiàn)于二十世紀九十年代中期,屬于黃病毒科、單股正鏈RNA病毒,基因組全長約9.4kb。GBV-C與艾滋病病毒(HIV-1)、丙型肝炎病毒(HCV)具有幾乎相同傳播途徑,在HIV/HCV單/共感染的靜脈吸毒人群(IDUs)中廣泛傳播。根據(jù)基因序列同源性,目前GBV-C可分為六種基因型,各基因型具有典型的地域分布特征。GBV-C病毒感染者無典型的臨床癥狀,但該病毒在與HIV-1共感染情況下,具有延緩艾滋病病程、抑制艾滋病病毒復(fù)制的作用,此作用與GBV-C基因型及相關(guān)基因序列特征具有較大的相關(guān)性。云南省地處我國西南邊陲,與東南亞多國接壤,毗鄰全球最大的毒品生產(chǎn)地——金三角地區(qū),是毒品運輸?shù)闹匾緩�。多項研究表�?血緣性病毒的傳播途徑和毒品運輸路徑直接相關(guān),云南省因此成為HIV-1和HCV傳入我國,并向其他省份傳播的源頭地區(qū),在云南地區(qū)開展血緣傳播病毒的分子流行病學(xué)研究顯得尤為重要。在云南省開展開展GBV-C的分子流行病學(xué),及在與HIV-1共感染情況下的疾病慢性化機制研究具有較大的科學(xué)意義和潛在應(yīng)用價值。 為調(diào)查云南地區(qū)GBV-C的感染情況,我們首先對該地區(qū)231例靜脈吸毒者和非靜脈吸毒者的GBV-C感染情況進行檢測,發(fā)現(xiàn)GBV-C E2抗體檢測陽性率為25.97%(60/231),GBV-C RNA檢測陽性率為32.04%(74/231),抗體／核酸交叉陽性率僅2.16%(5/231)。在靜脈吸毒人群中GBV-C/HIV/HCV的三重感染率明顯高于GBV-C單感染和GBV-C/HCV的共感染(P0.05)；在非靜脈吸毒人群中,GBV-C/HCV的共感染率明顯高于GBV-C/HIV/HCV三重感染率(P0.05)；GBV-C在HIV輕癥和重癥的患者中的感染率明顯高于在HIV中癥患者的感染(P0.05)。為驗證GBV-C對HIV-1和HCV感染者病程的影響,本研究對GBV-C感染與患者的CD4細胞數(shù)、ALT、AST、HCV的基因型和亞型、HIV-1 RNA病毒載量和HCV RNA病毒載量等相關(guān)指標的相關(guān)性進行了分析,GBV-C感染與否,以上指標未發(fā)現(xiàn)顯著變化。 為闡明GBV-C陽性患者中GBV-C基因型流行特點,本研究進而對GBV-C RNA陽性樣本的GBV-C 5'NCR、E2基因及病毒全基因進行擴增、序列測定與同源關(guān)系分析,發(fā)現(xiàn)43例GBV-C感染者中除1例(NK07)屬于3型,2例(DH019和DH021)屬于4型外,其它40例所感染毒株不屬于已知基因型且獨立成簇。Bootstrap值分別為：5'NCR,97%；E2,99%；Full-length,99%。全基因組核苷酸序列分析結(jié)果顯示,新基因型序列間相似性為91.2%-99.2%,不同基因型間相似性為86.2%-89%,Simplot和Bootscanning分析表明,所有獲得新基因型全基因組序列不存在型間重組現(xiàn)象,該毒株可被命名為GBV-C7型。基于現(xiàn)有數(shù)據(jù),云南省GBV-C基因型分布為：7型占93.02%(40/43)、4型占4.65%(2/43)、3型僅占2.33%(1/43)；在IDU人群中,7型為93.10%(27/29)、4型為6.90%(2/29)、沒有發(fā)現(xiàn)3型的存在；在非IDU人群中,7型為92.86%(13/14)、3型為7.14%(1/14)、未發(fā)現(xiàn)4型的存在。鑒于GBV-C基因分型尚無公認方法和界定標準,本研究提出了以GBV-C E2區(qū)序列為主要分型靶序列,平均遺傳距離小于0.0900視為同一基因型,介于0.1282～0.1438之間可視為不同基因型,平均遺傳距離介于0.0900～0.1282之間時,該毒株可能為基因重組型或者同一種基因型,需經(jīng)重組位點分析確定。 為揭示GBV-C起源與進化,本研究分別根據(jù)GBV-C全長基因組序列、5NCR、E1、E2和NS5B區(qū)的核酸序列變異情況,對GBV-C進化速率和可能起源時間進行推算,所得的GBV-C分子進化速率為10-5～10-2sub/site/year,推斷GBV-C的起源時間為152.96～1798.76年以前。比較而言,病毒E1/E2區(qū)(nt 900-1250)核酸序列更適合用于GBV-C的起源與進化研究,以此序列計算得到GBV-C五種基因型的分子進化速率介于10-4～10-2sub/site/year之間。根據(jù)各基因型病毒的地域分布、變異率和進化速率推斷其起源時間和可能起源地,發(fā)現(xiàn)GBV-C 1型起源于非洲西部(1238年)、GBV-C 2型起源于歐洲(1928年)、3型起源于日本(1987年)、4型起源于東南亞(1981年)、5型起源于非洲南部(1975年)�？偨Y(jié)我國主要GBV-C流行株的進化和傳播特點為,GBV-C 3型由日本傳播至中國,GBV-C 4型由東南亞分別經(jīng)云南地區(qū)傳播至中國內(nèi)陸地區(qū)。在云南省,GBV-C 4型可能以東南亞國家接壤的德宏地區(qū)、紅河地區(qū)和文山地區(qū)為源頭,傳播到云南省中部地區(qū)(大理和昆明地區(qū)),再經(jīng)中部地區(qū)向我國內(nèi)陸地區(qū)的傳播。 最后,為了探索GBV-C的自身高清除率的相關(guān)機制,本論文就宿主細胞microRNA對GBV-C復(fù)制的影響進行了研究。利用生物學(xué)相關(guān)軟件以GBV-C 3'NCR為靶基因預(yù)測了機體內(nèi)相關(guān)的rnicroRNA共計12種,從中篩選出最可能與GBV-C 3'NCR發(fā)生作用的三種microRNA,即Has-miR148a、Has-miR-152和Has-miR-301。進而,建立了此三種microRNA的莖環(huán)RT-PCR和SYBR染料的熒光定量PCR的檢測方法,以及GBV-C 3'NCR和三種microRNA的真核表達體系。研究結(jié)果表明,高表達miR-148a的Huh7.5.1細胞中,GBV-C 3'NCR基因的表達量明顯下降。然而,經(jīng)RNAi技術(shù)抑制miR-148a表達的細胞中,GBV-C 3'NCR基因表達量明顯上調(diào)。由此我們得出,Has-miR-148a與GBV-C 3'NCR之間呈負相關(guān)的生物學(xué)特性。 綜上所述,本論文通過對云南省不同人群和不同地區(qū)中GBV-C的感染、基因型流行、起源進化以及高清除率的相關(guān)機制的研究發(fā)現(xiàn),GBV-C在云南地區(qū)高度流行且發(fā)現(xiàn)了新的基因型并命名為GBV-C 7型,提出了以E2區(qū)序列為基礎(chǔ)的基因型分型的新標準；通過對GBV-C起源與進化的研究,闡明了我國和云南地區(qū)的GBV-C基因型進化特點和傳播路徑；證明了Has-miR-148a與GBV-C高清除率的相關(guān)性。本論文針對云南地區(qū)GBV-C的研究為首次,為今后在該地區(qū)開展相關(guān)研究提供了第一手資料,并為GBV-C和HIV共感染相關(guān)方面的研究提供了前瞻性的建議,同時為GBV-C影響HIV患者疾病進程的研究提供了參考和理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：庚型肝炎病毒 靜脈吸毒人群 云南省 起源與進化 microRNA
【學(xué)位授予單位】：昆明理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R181.3
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-18
• 插圖與附表清單18-23
• 英文縮寫詞表23-25
• 第一章 緒論25-49
• 1.1 庚型肝炎病毒25-39
• 1.1.1 庚型肝炎病毒的發(fā)現(xiàn)和命名25
• 1.1.2 庚型肝炎病毒的結(jié)構(gòu)及其基因組特征25-28
• 1.1.3 庚型肝炎病毒的診斷28-30
• 1.1.4 庚型肝炎病毒的基因型的分布及分型方法30-35
• 1.1.5 庚型肝炎病毒的起源與進化35-39
• 1.2 庚型肝炎病毒傳播和流行39-41
• 1.2.1 庚型肝炎病毒的傳播途徑39-40
• 1.2.2 庚型肝炎病毒的流行40-41
• 1.3 庚型肝炎病毒的生物學(xué)特性41-45
• 1.3.1 庚型肝炎病毒的致病性41-42
• 1.3.2 庚型肝炎病毒與艾滋病病毒42-45
• 1.4 研究云南地區(qū)病毒分子流行病學(xué)的意義45-47
• 1.4.1 云南省特殊的地理位置45
• 1.4.2 云南地區(qū)病毒傳播對我國病毒流行的影響45-47
• 1.5 本論文研究的目的和意義47-48
• 1.6 本論文的創(chuàng)新點48-49
• 第二章 云南省GBV-C的流行及其與臨床指標的相關(guān)性分析49-66
• 2.1 引言49-50
• 2.2 本章技術(shù)路線50
• 2.3 實驗材料和方法50-52
• 2.3.1 實驗材料50
• 2.3.2 主要試劑50-51
• 2.3.3 儀器設(shè)備51
• 2.3.4 實驗方法51-52
• 2.4 實驗結(jié)果52-62
• 2.4.1 本研究樣本臨床指標統(tǒng)計52-53
• 2.4.2 云南地區(qū)不同人群中GBV-C RT-PCR檢測結(jié)果53-54
• 2.4.3 云南省GBV-C的流行54
• 2.4.4 云南省靜脈吸毒人群中不同病原體的感染率分析54-55
• 2.4.5 云南省非靜脈吸毒人群中不同病原體的感染率分析55-56
• 2.4.6 云南省不同地州和不同人群的GBV-C感染情況56-57
• 2.4.7 云南省靜脈吸毒人群HIV患者不同病程中GBV-C的流行57-58
• 2.4.8 云南省靜脈吸毒人群中GBV-C對HIV/HCV共感染患者影響58-59
• 2.4.9 云南省靜脈吸毒人群中GBV-C對HCV患者的影響59-60
• 2.4.10 云南省非靜脈吸毒人群中GBV-C對HCV患者的影響60
• 2.4.11 云南省不同人群中GBV-C與HCV基因型和亞型的相關(guān)性分析60-62
• 2.5 討論62-65
• 2.5.1 云南省不同地區(qū)不同人群中GBV-C的感染率62
• 2.5.2 本研究中GBV-C診斷指標的選擇62-63
• 2.5.3 本研究中GBV-C感染的偏好性63-64
• 2.5.4 本研究中GBV-C的感染與HIV患者臨床指標的相關(guān)性64
• 2.5.5 GBV-C影響HIV患者臨床指標的研究64-65
• 2.6 小結(jié)65-66
• 第三章 云南地區(qū)GBV-C基因型分布與新基因型的發(fā)現(xiàn)66-90
• 3.1 引言66-67
• 3.2 本章技術(shù)路線67-68
• 3.3 實驗材料和方法68-72
• 3.3.1 實驗材料68
• 3.3.2 主要試劑68
• 3.3.3 儀器設(shè)備68
• 3.3.4 實驗方法68-72
• 3.4 實驗結(jié)果72-83
• 3.4.1 GBV-C 5'NCR和E2區(qū)RT-PCR的擴增72-73
• 3.4.2 GBV-C 5'NCR和E2區(qū)擴增片段測序結(jié)果73-74
• 3.4.3 GBV-C 5'NCR和E2區(qū)序列基因分型的能力分析74-75
• 3.4.4 基于GBV-C 5'NCR區(qū)序列對GBV-C的基因分型75-76
• 3.4.5 基于GBV-C E2區(qū)序列對GBV-C的基因分型76-77
• 3.4.6 GBV-C全基因組序列的擴增77-78
• 3.4.7 GBV-C全基因組序列片段測序和序列拼接78
• 3.4.8 GBV-C 7型與其它基因型間核苷酸序列相似性比較78-79
• 3.4.9 基于GBV-C全長基因序列對GBV-C的基因型的分析79-80
• 3.4.10 GBV-C 7型重組位點的分析80-81
• 3.4.11 云南省GBV-C基因型的流行特點81-82
• 3.4.12 GBV-C E2區(qū)與HIV相互作用的氨基酸位點的分析82-83
• 3.5 討論83-88
• 3.5.1 GBV-C基因型的命名83
• 3.5.2 GBV-C基因分型的標準83-86
• 3.5.3 我國GBV-C基因型流行特點86-87
• 3.5.4 云南省GBV-C基因型流行及其分析87-88
• 3.5.5 GBV-C與HIV間的相互作用88
• 3.6 小結(jié)88-90
• 第四章 庚型肝炎病毒的起源與進化90-119
• 4.1 引言90-91
• 4.2 技術(shù)路線圖91-92
• 4.3 材料與方法92-94
• 4.3.1 實驗材料92
• 4.3.2 主要軟件92
• 4.3.3 實驗方法92-94
• 4.4 實驗結(jié)果94-111
• 4.4.1 GBV-C的進化速率94-95
• 4.4.2 GBV-C的起源95-96
• 4.4.3 GBV-C的基因組序列的變異特征96-97
• 4.4.4 基于高變區(qū)序列進行GBV-C的基因分型97-98
• 4.4.5 基于E1/E2高變區(qū)序列進行GBV-C的基因分型98-99
• 4.4.6 不同基因型GBV-C的分子進化速率99-100
• 4.4.7 GBV-C五種基因型流行及其進化特征100-109
• 4.4.8 南省GBV-C主要基因型的流行及其進化特征109-111
• 4.5 討論111-118
• 4.5.1 GBV-C的分子進化速率111-114
• 4.5.2 GBV-C進化速率的選擇114
• 4.5.3 GBV-C各基因型起源進化的比較114-115
• 4.5.4 中國GBV-C主要流行株的傳播115-117
• 4.5.5 研究病毒起源及其進化動力學(xué)的意義117-118
• 4.6 小結(jié)118-119
• 第五章 庚型肝炎病毒自身高清除率與機體microRNA的相關(guān)性119-143
• 5.1 引言119-120
• 5.2 技術(shù)路線120-121
• 5.3 實驗材料與方法121-125
• 5.3.1 實驗材料121-122
• 5.3.2 主要試劑122-123
• 5.3.3 儀器設(shè)備123
• 5.3.4 實驗方法123-125
• 5.4 實驗結(jié)果125-134
• 5.4.1 與GBV-C 3'NCR區(qū)序列相關(guān)的microRNA預(yù)測125-127
• 5.4.2 GBV-C 3'NCR區(qū)序列相關(guān)microRNA的篩選127
• 5.4.3 GBV-C3'NCR和microRNA基因定性PCR檢測127-128
• 5.4.4 GBV-C 3'NCR和microRNA基因的測序結(jié)果128-129
• 5.4.5 GBV-C 3'NCR和microRNA基因熒光定量PCR檢測方法的建立129-130
• 5.4.6 GBV-C 3'NCR與microRNA基因真核表達體系的建立130-132
• 5.4.7 microRNA與GBV-C 3'NCR間的相互作用132
• 5.4.8 Has-mir-148a與GBV-C 3'NCR間的相互作用132-134
• 5.5 討論134-141
• 5.5.1 MicroRNA的檢測方法的選擇134-136
• 5.5.2 本研究檢測體系中參照基因的選擇136-137
• 5.5.3 Has-miR-148a與GBV-C 3'NCR間的相互作用137-138
• 5.5.4 Has-miR-148a與GBV-C 3'NCR作用位點的分析138-139
• 5.5.5 Has-miR-148a的其它生物學(xué)功能139-140
• 5.5.6 GBV-C的高清除率與Has-miR-148a的相關(guān)性140-141
• 5.6 小結(jié)141-143
• 第六章 結(jié)論與展望143-147
• 致謝147-148
• 參考文獻148-161
• 附錄A 攻讀碩士期間發(fā)表論文目錄161

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前9條

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本文編號：821560