本文關(guān)鍵詞：上海和內(nèi)蒙古地區(qū)輸血性傳播病毒的流行病學(xué)調(diào)查及ORF1基因的克隆表達(dá)

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【摘要】：輸血型傳播病毒(Torque Teno virus,TTV)是由Nishizawa[1]于1997年在研究原因不明肝炎患者的過程中,用RDA(代表性差異技術(shù))方法從一名58歲的日本患者血液中分離到的一種病毒,是繼甲、乙、丙、丁、戊、己、庚之后的又一肝炎病毒--辛型肝炎病毒,從屬與指環(huán)病毒科(Anellovirida)。該病毒為單股環(huán)狀DNA,病毒基因組長度在2.1-3.9 KB之間,有兩個(gè)主要的開放閱讀框(ORF),ORF1可能編碼病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白,ORF2主要編碼非結(jié)構(gòu)蛋白。TTV能感染人、非人靈長類、豬、犬、貓、牛、羊、駱駝等哺乳動(dòng)物,對禽類的感染也有報(bào)道,但是,TTV的大小及特性在不同物種中差異較大,僅人的TTV就存在40多個(gè)基因型。TTV感染范圍較寬,傳播途徑較廣,與人類隱性肝病密切相關(guān),因此引起了世界各國學(xué)者的廣泛關(guān)注。 本試驗(yàn)根據(jù)GeneBank公開發(fā)表的SAa-10(AB060594)全序列設(shè)計(jì)型特異性引物,通過巢式PCR方法檢測來自上海某兒童醫(yī)院的150份、年齡在1個(gè)月到8歲之間的兒童糞樣和109份成年人血樣,來自內(nèi)蒙的96份中老年人的糞樣,結(jié)果發(fā)現(xiàn):內(nèi)蒙96份中老年人糞樣中沒有陽性樣品,上海150份兒童糞樣中檢測到3份,上海109份血樣中有8份陽性,陽性樣品的序列與SAa-10序列以及不同陽性樣品序列間的同源性均在90%以上,說明TTV的感染不存在地域差異性,但是,感染率可能與年齡有一定的相關(guān)性。 參照SAa-10(AB060594)對其中一份陽性樣品進(jìn)行全序列擴(kuò)增,命名為L-SH (HM224451),通過Cluster比對及Mega 4.0進(jìn)行進(jìn)化樹分析表明,本實(shí)驗(yàn)分離株L-SH (HM224451)與日本株SAa-10(AB060594)的同源性達(dá)93.8%,進(jìn)一步說明了同一基因型TTV之間不存在地域差異。對分離株L-SH ORF1中的蛋白,運(yùn)用DNA-Star中Protean軟件進(jìn)行抗原表位分析,選取抗原表位密集的區(qū)域設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增,并連接到表達(dá)載體PET-30中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),此蛋白能高效表達(dá)并以包涵體形式存在,為后續(xù)TTV的ELISA檢測和疫苗抗原的研究進(jìn)行有意義的探索。
【關(guān)鍵詞】：TT病毒 流行病學(xué)調(diào)查 ORF1 克隆表達(dá)
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R181.3
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-8
• 1 引言8-18
• 1.1 發(fā)展簡史9
• 1.2 TTV 作為一種新型肝炎病毒的發(fā)現(xiàn)9-12
• 1.2.1 歷史9
• 1.2.2 理化性質(zhì)9-10
• 1.2.3 單鏈環(huán)狀 DNA 病毒10-11
• 1.2.4 TTV 的變異11-12
• 1.3 流行病學(xué)12-14
• 1.3.1 感染途徑12-13
• 1.3.2 TTV 在不同人群中的感染率13-14
• 1.3.3 地區(qū)分布14
• 1.4 TTV 的檢測方法14-15
• 1.5 TTV 和它的潛在致病性15-17
• 1.5.1 肝臟疾病15
• 1.5.2 血液疾病15-16
• 1.5.3 肺部疾病16
• 1.5.4 特發(fā)性炎癥性肌病16
• 1.5.5 免疫抑制16
• 1.5.6 系統(tǒng)性紅斑狼瘡16-17
• 1.6 動(dòng)物 TTV17-18
• 1.6.1 非人靈長類的 TTV17
• 1.6.2 其他動(dòng)物的 TTV17-18
• 1.7 本研究的目的與意義18
• 2. 上海地區(qū)和內(nèi)蒙古呼和浩特市地區(qū)人 TTV 的流行病學(xué)調(diào)查18-22
• 2.1 材料18-19
• 2.1.1 樣品18
• 2.1.2 主要試劑18-19
• 2.1.3 主要儀器19
• 2.2 試驗(yàn)方法19-21
• 2.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成19
• 2.2.2 樣品處理19
• 2.2.3 DNA 模板的制備19-20
• 2.2.4 目的片段的擴(kuò)增20
• 2.2.5 PCR 產(chǎn)物的凝膠電泳檢測20
• 2.2.6 PCR 產(chǎn)物凝膠回收20-21
• 2.2.7 回收產(chǎn)物與pMD18-T 載體連接反應(yīng)21
• 2.2.8 轉(zhuǎn)化及測序21
• 2.3 結(jié)果與討論21-22
• 2.3.1 樣品中TTV 第20 型 SAa-10 的檢測21-22
• 2.3.2 討論22
• 3. TTV 基因的全長擴(kuò)增22-28
• 3.1 主要試劑和儀器23-24
• 3.1.1 主要試劑23
• 3.1.2 主要儀器23
• 3.1.3 材料23
• 3.1.4 引物設(shè)計(jì)23-24
• 3.2 試驗(yàn)方法24-25
• 3.2.1 PCR 擴(kuò)增24
• 3.2.2 電泳24
• 3.2.3 PCR 產(chǎn)物凝膠回收24-25
• 3.2.4 回收產(chǎn)物與pMD18-T 載體連接反應(yīng)25
• 3.2.5 轉(zhuǎn)化及測序25
• 3.3 結(jié)果與分析25-28
• 3.3.1 結(jié)果25-27
• 3.3.2 進(jìn)化分析27-28
• 3.4 討論28
• 4. TTV ORF1 基因的原核表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá)蛋白的純化28-38
• 4.1 材料29
• 4.1.1 樣品、菌株和質(zhì)粒29
• 4.1.2 主要試劑29
• 4.1.3 主要儀器29
• 4.2 試驗(yàn)方法29-34
• 4.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成29-30
• 4.2.2 PCR 擴(kuò)增30
• 4.2.3 目的片段的回收30-31
• 4.2.4 目的基因的克隆31
• 4.2.4 克隆質(zhì)粒的構(gòu)建31-32
• 4.2.5 原核表達(dá)載體PET-30a-ORF1 的構(gòu)建32-33
• 4.2.6 重組表達(dá)載體的誘導(dǎo)表達(dá)33
• 4.2.7 最優(yōu)表達(dá)時(shí)間的確定33-34
• 4.2.8 表達(dá)產(chǎn)物的純化34
• 4.2.9 表達(dá)產(chǎn)物的復(fù)性34
• 4.3 結(jié)果34-37
• 4.3.1 ORF1 基因的 PCR 結(jié)果34-35
• 4.3.2 目的基因的克隆鑒定35
• 4.3.3 重組表達(dá)載體的鑒定35-36
• 4.3.4 蛋白原核表達(dá)及最優(yōu)表達(dá)時(shí)間的確定36
• 4.3.5 蛋白的可溶性分析36-37
• 4.3.6 蛋白的純化與復(fù)性37
• 4.4 討論37-38
• 5. 結(jié)論38
• 6. 展望38-39
• 致謝39-40
• 參考文獻(xiàn)40-45
• 作者簡歷45

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

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本文編號：810059