研究背景和目的 兒童手足口病(hand-foot-mouth disease, HFMD)是一種常見(jiàn)的傳染性強(qiáng)、傳播途徑復(fù)雜、在短時(shí)間內(nèi)可造成較大規(guī)模流行病毒感染性疾病,其主要病原體是柯薩奇病毒A組16型(Coxsackievirus A16, CA16)和腸道病毒71型(Enterovirus71,EV71)。大多數(shù)HFMD患者癥狀輕微,主要以手,足、口等部位皮膚粘膜的皰疹、潰瘍?yōu)橹饕卣?伴有全身癥狀如發(fā)熱、厭食、乏力、精神萎靡等。少數(shù)患兒可出現(xiàn)中樞神經(jīng)、呼吸系統(tǒng)損害,引發(fā)腦炎、急性弛緩性麻痹、腦水腫、肺水腫和心肌炎等,個(gè)別重癥患兒病情進(jìn)展快,易發(fā)生死亡。EV71由于能引起嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)癥狀而得到高度重視,對(duì)其研究也較為深入。相反,CA16卻由于引起較輕的臨床癥狀不受關(guān)注,一直被作為需要與EV71鑒別診斷的病毒附帶進(jìn)行研究,流行病學(xué)資料很少,也沒(méi)有統(tǒng)一的基因分型標(biāo)準(zhǔn)。然而,近年已有報(bào)道指出CA16感染可能與心肌炎、心包炎及其它嚴(yán)重疾病有關(guān),甚至還可引起成人致死性肺炎。因此,開(kāi)展CA16感染的流行病學(xué)研究,可為防控CA16病毒引起的相關(guān)疾病提供基礎(chǔ)信息。基于此,本研究擬對(duì)2005-2009年期間深圳市的HFMD患者進(jìn)行CA16病原學(xué)檢測(cè),對(duì)CA16分離株VPl區(qū)進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定,并與國(guó)內(nèi)外CA16毒株進(jìn)行同源性分析,旨在了解深圳地區(qū)CA16病毒的流行情況及基因型特征,以期為HFMD的綜合防治和CA16病毒的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)提供依據(jù),并豐富CA16毒株基因庫(kù)及分子流行病學(xué)資料。 CA16常規(guī)檢測(cè)方法主要有病毒分離、免疫組化、中和試驗(yàn)及逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR).經(jīng)典的細(xì)胞分離培養(yǎng)、特異性抗體檢測(cè)方法步驟煩瑣,檢測(cè)周期長(zhǎng),而且一些腸道病毒難以在細(xì)胞中進(jìn)行增殖,容易出現(xiàn)漏檢；基于CA16核酸擴(kuò)增的分子生物學(xué)診斷技術(shù)如PCR、RT-PCR、Real-Time RT-PCR (real-time fluorescent RT-PCR)等在病原微生物的檢測(cè)以及疫病診斷方面發(fā)揮著重大作用,克服了以上缺點(diǎn),敏感度、特異性較高,已成為目前CA16快速診斷的重要手段,但這些方法或者需要精密控溫設(shè)備和高級(jí)復(fù)雜的分析儀器,或者對(duì)操作人員的熟練度和專業(yè)水平要求比較高,且反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng),不利于現(xiàn)場(chǎng)樣品的檢測(cè),不利于在基層推廣,無(wú)法滿足簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確診斷的要求,而疫病的防控和治療的關(guān)鍵在于對(duì)病原微生物的快速、準(zhǔn)確、及早的檢測(cè)并確診。因此,建立一種快速、準(zhǔn)確的新型診斷技術(shù)對(duì)于CA16的診斷就顯得尤為重要。 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技術(shù)是Notomi等2000年建立的一種新的核酸擴(kuò)增方法。其原理是利用一種鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)和兩對(duì)特殊的引物,特異地識(shí)別靶序列上的6個(gè)獨(dú)立區(qū)域,在等溫條件下(65℃左右)保溫幾十分鐘,即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)果可直接靠擴(kuò)增副產(chǎn)物焦磷酸鎂的沉淀濁度進(jìn)行判斷,也可以由添加SYBR Green I、溴化乙啶(EB)或其它核酸染劑進(jìn)行呈色后觀察。其優(yōu)點(diǎn)是特異性強(qiáng),擴(kuò)增效率高,反應(yīng)靈敏,操作簡(jiǎn)單。LAMP技術(shù)目前已被國(guó)內(nèi)外學(xué)者應(yīng)用到多種細(xì)菌及病毒的基因檢測(cè)中,但至今尚未檢索到使用該技術(shù)檢測(cè)CA16的報(bào)道。本研究擬建立CA16病毒逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(RT-LAMP)技術(shù),并比較該技術(shù)與RT-PCR及Real-Time RT-PCR對(duì)深圳市臨床診斷HFMD患者標(biāo)本的CA16基因檢測(cè)效果,旨在為臨床CA16感染診斷尋求快速、簡(jiǎn)便、可行的新方法。 方法 1．CA16病毒分子流行病學(xué)特征 首先用熒光RT-PCR方法對(duì)深圳地區(qū)2005-2009年5年間所有HFMD病例進(jìn)行CA16病毒快速檢測(cè),再選取每年具有代表性的陽(yáng)性株用CA16特異性引物對(duì)VPl基因進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物用于核苷酸序列測(cè)定,所得的序列與CA16各基因型代表株進(jìn)行比較,用DNASTAR和Mega 4.1軟件進(jìn)行種系進(jìn)化分析。 2.CA16病毒RT-LAMP檢測(cè)方法的建立 首先針對(duì)CA16VP1區(qū)保守序列設(shè)計(jì)RT-LAMP引物,對(duì)引物進(jìn)行反復(fù)篩選,選擇最優(yōu)引物組合,其次對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化,再對(duì)優(yōu)化的RT-LAMP體系進(jìn)行靈敏性、特異性、重復(fù)性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,并運(yùn)用于臨床樣本檢測(cè),初步評(píng)價(jià)CA16 RT-LAMP檢測(cè)技術(shù)的可操作性。 結(jié)果： 1．CA16病毒分子流行病學(xué)特征分析 2005年～2009年共收集HFMD患者標(biāo)本1161份,CA16檢出占HFMD患者的21.4%,每年的檢出率分別為：2005年27.0%,2006年51.6%,2007年27.6%；2008年17.8%；2009年17.0%。主要引起5歲以下兒童(92.7%)的感染,男女性別之間發(fā)病差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.469),發(fā)病高峰為每年的夏秋季節(jié),病例大多集中在3-6月,9-11月還有一次小流行,龍崗區(qū)、寶安區(qū)(郊區(qū))的發(fā)病顯著高于福田區(qū)、南山區(qū)、羅湖區(qū)、鹽田區(qū)(城區(qū))。 本研究選取的69株CA16深圳分離株VP1區(qū)核苷酸和氨基酸同源性分別為96.8%和99.9%�；�25株深圳代表株與38株國(guó)內(nèi)國(guó)際參考株的比較分析,參考EV71分型標(biāo)準(zhǔn)及Perera等的CA16分型標(biāo)準(zhǔn),CA16可分為A、B兩種基因型,B型可分為B1、B2亞型,B2亞型又可分為B2a、B2b、B2c基因亞群,之前報(bào)道的B和C基因型應(yīng)歸于同一B基因型下二個(gè)分支,B基因型應(yīng)該歸于B1基因亞型,C基因型應(yīng)該歸于B2基因亞型。各基因型間氨基酸變異位點(diǎn)分析未發(fā)現(xiàn)特異性突變。2005-2009年深圳分離株在CA16進(jìn)化樹(shù)上分別位于B2a(66.7%)和B2b(33.3%)分支上,且與同一時(shí)期同一基因型別國(guó)內(nèi)國(guó)際CA16分離株的同源性較高。 2.CA16病毒RT-LAMP檢測(cè)方法 建立的RT-LAMP檢測(cè)方法快速、簡(jiǎn)便、成本低,反應(yīng)在60min內(nèi)完成,與Real-time RT-PCR和常規(guī)RT-PCR相比,分別節(jié)省了近30 min和90 min。本方法檢測(cè)極限是81拷貝/管,與Real-time RT-PCR比較,敏感性相同,均比普通RT-PCR方法高10倍。本法有較高的特異性和重復(fù)性,未發(fā)現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。臨床標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果與Real-time RT-PCR檢測(cè)結(jié)果具有良好的一致性。 結(jié)論： 1.2005年～2009年,深圳市HFMD患者的CA16檢出率為21.4%,CA16是該期間HFMD的主要病原之一；CA16主要感染5歲以下兒童,男女性別之間發(fā)病沒(méi)有顯著性差異；發(fā)病高峰為每年的夏秋季節(jié),病例大多集中在3-6月,9-11月還有一次小流行；郊區(qū)CA16感染顯著高于城區(qū)。 2.深圳市檢測(cè)到的CA16可分為A、B兩種基因型,B型可分為B1、B2亞型,B2亞型又可分為B2a、B2b、B2c基因亞群,之前報(bào)道的B和C基因型應(yīng)歸于同一B基因型下二個(gè)分支,B基因型應(yīng)該是B1基因亞型,C基因型應(yīng)該是B2基因亞型。各基因型間氨基酸變異位點(diǎn)分析未發(fā)現(xiàn)特異性突變,說(shuō)明CA16的進(jìn)化速度緩慢；69株深圳分離株基因型別為B2a和B2b,其中B2a有46株,占66.7%,B2b有23株,占33.3%；69株CA16深圳分離株VP1區(qū)核苷酸和氨基酸同源性均較高,且每年分離株組內(nèi)核苷酸和氨基酸同源性均較高。 3.首次針對(duì)CA16的VPl基因設(shè)計(jì)RT-LAMP引物,建立了RT-LAMP方法,并對(duì)其特異性和敏感性進(jìn)行了驗(yàn)證。 4.本研究建立的RT-LAMP方法在反應(yīng)時(shí)間方面,比RT-PCR快近90 min,比Real-time RT-PCR快30 min；在單樣本檢測(cè)成本方面,比Real-time RT-PCR低約4倍,比RT-PCR低2倍。 5.本研究建立的RT-LAMP方法對(duì)臨床診斷HFMD患者標(biāo)本進(jìn)行CA16基因檢測(cè)結(jié)果與Real-time RT-PCR結(jié)果具有良好的一致性。
【學(xué)位單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2011
【中圖分類】：R725.1;R181.3
【部分圖文】：

性病毒感染性疾病，由多種腸道病毒(EnieroviruS)引起，分布廣泛，無(wú)明顯的地區(qū)性，四季均可發(fā)病，以夏秋季高發(fā)。該病傳染性強(qiáng)，傳播途徑復(fù)雜，在短時(shí)間內(nèi)可造成較大規(guī)模流行[1]。HFMD以嬰幼兒發(fā)病為主，主要呈散發(fā)，托幼機(jī)構(gòu)或兒童聚集的單位也可出現(xiàn)暴發(fā)。少年兒童和成人感染后多不發(fā)病，但能夠傳播病毒。大多數(shù)患者癥狀輕微，以手，足、口、臀等部位皮膚粘膜的疤疹、潰瘍?yōu)橹饕卣?圖l)，瘡疹多出現(xiàn)在頰粘膜、舌部、牙齲、手掌和足心，亦可見(jiàn)于臀部，多伴有全身癥狀如發(fā)熱、厭食、乏力、精神萎靡等[2]。少數(shù)患兒可出現(xiàn)中樞神經(jīng)、呼吸系統(tǒng)損害，引發(fā)腦炎、急性弛緩性麻痹、腦水腫、肺水腫和心肌炎等，個(gè)別重癥患兒病情進(jìn)展快，易發(fā)生死亡。HFMD流行期間，幼兒園和托兒所易發(fā)生集體感染，家庭也亦可發(fā)生聚集發(fā)病現(xiàn)象。一旦出現(xiàn)腦炎、無(wú)菌性腦膜炎、肺水腫、肺出血、急性軟癱和心肌炎等合并癥，常導(dǎo)致患者死亡，因此HFMD已成為一種嚴(yán)重危害嬰幼兒的傳染性疾病。

FZ的方向或是Bl到BZ的方向結(jié)合。這樣，所有的莖環(huán)DNA或者與內(nèi)引物雜交.或者與Loop引物雜交，從而加快了反應(yīng)速度。使用Loop引物的LAMP反應(yīng)比原來(lái)的LAMP反應(yīng)時(shí)間縮短近一半.提高了檢測(cè)效率(圖4)。LAMP反應(yīng)原理具體可參見(jiàn) :http://loopamp.eiken.eojp/e/lamp/prineiple.htmL。，·解篇纂{ eFle了“儀尸tl.)戈 1BlBZB3甲翻鉑甲州，，叭唇尸，，，愉麒鉀沖州梢牌撇科甲5’粼麟溯..城!纂竇攀粼..姍姍濃一湍~翻口.翔.翻 F3FZFIBlcBZ亡B3cF3公 FZcFle盡正 ;!BZB3(1》3，條嬰知翻腳5海巾一護(hù)l川吐血霉侄拼ndd薪，戶枕滋七.〔云t玉v石北y溯麟麟翻動(dòng)翻姍城墉熬粗...........側(cè)了‘戶噢卿妙硯一成《2) F3CFZCFICBIRZB3‘”畫澎擠鉀，嘴烹聲東’3咭

圖5LAMP技術(shù)流程圖F19.5.StandardProeeduresofLAMP六、LA五廈p技術(shù)的應(yīng)用目前應(yīng)用LAMP技術(shù)檢測(cè)的病毒主要有:乙型肝炎病毒、、流感病毒、單純瘡疹病毒、水痘一帶狀疤疹病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、腺病毒、SARS冠狀病毒、呼吸道合胞病毒、西尼羅河病毒等。應(yīng)用于細(xì)菌性疾病的檢測(cè)主要有結(jié)核分支桿菌、痢疾志賀菌、大腸桿菌、螺旋體、肺炎鏈球菌和耶氏菌等。1.DNA病毒的檢測(cè)Enomoto等l，2]及Kaneko等[531分別采用LAMP和聚合酶鏈反應(yīng)(pCR)兩種方法進(jìn)行DNA擴(kuò)增7型人類疤疹病毒的DNA，采用焦磷酸鎂濁度檢測(cè)法時(shí)，
【引證文獻(xiàn)】

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1 張文慧;柯薩奇病毒A16的分離及其滅活疫苗的免疫原性研究[D];昆明理工大學(xué);2012年

本文編號(hào)：2858853