【摘要】：環(huán)孢子蟲(Cyclospora)為艾美球蟲科(Eimeriidae)環(huán)孢子蟲屬(Cyclospora)成員,在世界范圍內(nèi)流行傳播,具廣泛宿主。環(huán)孢子蟲為一種新近發(fā)現(xiàn)的腸道寄生原蟲,主要寄生于宿主小腸的上皮細(xì)胞,可引起宿主食欲減退、體重減輕、持續(xù)性腹瀉、腸痙攣及其它胃腸炎等臨床癥狀。免疫功能正常者感染環(huán)孢子蟲后主要引起自限性腹瀉,而對于免疫抑制者或免疫功能缺陷者,感染環(huán)孢子蟲后則可致持續(xù)性腹瀉甚至死亡。近年來,環(huán)孢子蟲病受到國內(nèi)外越來越多研究人員的廣泛關(guān)注和重視。2008年7月到2010年1月,采用福爾馬林-乙酸乙酯沉淀法、飽和蔗糖溶液漂浮法和改良抗酸染色法對河南省鄭州地區(qū)3家醫(yī)院的病人進(jìn)行環(huán)孢子蟲的感染情況進(jìn)行調(diào)查,共發(fā)現(xiàn)環(huán)孢子蟲感染者29例。用PCR方法對其18Sr RNA基因和ITS-1基因擴(kuò)增,序列比對結(jié)果經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育分析,所獲環(huán)孢子蟲蟲株均屬于卡耶塔環(huán)孢子蟲。 本次試驗共調(diào)查5285名病人,總感染率為0.5%(29/5825)。其中,河南省人民醫(yī)院、鄭州市兒童醫(yī)院和鄭州大學(xué)三附院病人環(huán)孢子蟲感染率分別為0.5%(22/4836)、0.5%(3/608)和1.0%(4/381);春季、夏季、秋季和冬季環(huán)孢子蟲感染率分別為0.0%(0/823)、1.0%(21/2017)、0.4%(8/1878)和0.0%(0/567),表明環(huán)孢子蟲感染與季節(jié)具有明顯相關(guān)性(P0.01);此次調(diào)查發(fā)現(xiàn)各個年齡段均發(fā)現(xiàn)有環(huán)孢子蟲感染,其中以0~17歲和60歲以上感染率較高,表明環(huán)孢子蟲感染與年齡具有相關(guān)性(P0.05);男性的環(huán)孢子蟲感染率為0.6%(19/3154),女性的感染率為0.5%(10/2131) ,表明環(huán)孢子蟲感染與性別無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。100倍光學(xué)顯微鏡下測量50個環(huán)孢子蟲卵囊,大小為7.5μm×7.5μm。 基于18S rRNA基因和ITS-1基因?qū)?9個環(huán)孢子蟲陽性樣品進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增,對擴(kuò)增出的29個環(huán)孢子蟲樣品的18S rRNA基因和7個環(huán)孢子蟲樣品的ITS-1基因進(jìn)行測序,拼接比對后的序列通過NCBI、EMBL和DDBJ三大分子生物學(xué)數(shù)據(jù)庫搜索同源序列,然后運用Clustal X1.81、Phylip3.64和DNAstar5.0等分子生物學(xué)軟件對所獲得的序列進(jìn)行比對分析、構(gòu)建分子進(jìn)化樹�；�18S rRNA基因位點分析,結(jié)果表明29個人源環(huán)孢子蟲樣品與C. cayetanensis進(jìn)化關(guān)系最為接近,僅存在兩個堿基差異。而根據(jù)在ITS-1基因位點種系進(jìn)化分析,表明同一地理位置的分離株同源性較高。 本研究對河南省鄭州地區(qū)人源環(huán)孢子蟲流行狀況進(jìn)行了調(diào)查,了解對了人源環(huán)孢子蟲在河南省的流行情況及特點,并運用分子生物學(xué)方法進(jìn)行了分析,掌握了河南省人源環(huán)孢子蟲遺傳特征及分子特性,為以后人源環(huán)孢子蟲在全國范圍內(nèi)的研究奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

環(huán)孢子蟲在微分干涉（DIC）顯微鏡下呈球形，雖有一個清晰的卵囊壁，，但易與其它球形物質(zhì)混淆，不易辨別。在紫外熒光（UV）顯微鏡下環(huán)孢子蟲卵囊壁自發(fā)熒光，在330~365nm光譜下環(huán)孢子蟲顯示藍(lán)色光，在450~490nm光譜下環(huán)孢子蟲顯示綠色光(圖1-1)。圖1-1 微分干涉顯微鏡紫外熒光顯微鏡下環(huán)孢子蟲卵囊Fig 1-1 C. cayetanensis oocysts under DIC and UV microscope5. 2.2 改良抗酸染色法改良抗酸染色法是國際上應(yīng)用最廣泛的C. cayetanensis檢測方法。環(huán)孢子蟲經(jīng)改良抗算染色法染色后，在藍(lán)綠色背景下，卵囊結(jié)構(gòu)比較明顯。卵囊著色從亮粉色到深紫色不等，有一些不著色。卵囊形態(tài)差異較大，有的呈圓形，有的卵囊壁向內(nèi)凹陷或者扭曲變形(圖1-2)。

囊染色均一，為紅色到紅橙色，可以減少誤診率，但該法需使用加熱設(shè)備進(jìn)行加熱處理。 (圖1-3)。圖1-2 改良抗酸染色法染色后的環(huán)孢子蟲卵囊Fig 1-2 C. cayetanensis oocysts stained with modified acid-fast technique.圖1-3 番紅精染色法染色后的環(huán)孢子蟲卵囊Fig 1-3 C. cayetanensis oocysts stained with the safranin stain technique5. 2.4 三色染色法三色染色法是大部分實驗室常規(guī)的糞便檢測方法，能檢測出環(huán)孢子蟲卵囊，但卵囊均不著色，不能準(zhǔn)確鑒別卵囊。利用該法可檢測出環(huán)孢子蟲卵囊但無法確認(rèn)，因此，該法可用于疑似含有環(huán)孢子蟲卵囊的樣品。5.3 孢子化實驗新鮮糞便樣本中的環(huán)孢子蟲卵囊均未孢子化，內(nèi)部結(jié)構(gòu)不易觀察。將環(huán)孢子蟲卵囊于2.5％重鉻酸鉀溶液中，室溫下完成孢子化需7~13d，100倍光學(xué)顯微鏡下可見2個孢子囊，每個卵圓形孢子囊含2個子孢子（圖1-4）。1997年，Smith[48]等報道環(huán)孢子蟲孢子化所需溫度的范圍為22~30℃
【學(xué)位授予單位】：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R181.3

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本文編號：2577324