【摘要】： 研究背景:昆蟲的生長發(fā)育是通過定期的蛻皮實(shí)現(xiàn)的,蛻皮過程是在甾醇、保幼激素、20-羥基蛻皮激素(20-hydroxyecdysone,20E)等幾種昆蟲激素的調(diào)節(jié)下完成的。20E的受體是種核受體,由蛻皮激素受體(ecdysone receptor,EcR)及超螺旋蛋白(ultraspiracle protein,USP)組成,在20E的誘導(dǎo)下EcR與USP結(jié)合形成二聚體時,只有EcR/USP二聚體才能與位于蛻皮激素可誘導(dǎo)基因啟動子區(qū)的蛻皮激素響應(yīng)元件(ecdysone response element,EcRE)相結(jié)合而啟動早期基因的轉(zhuǎn)錄。如果這種激素依賴性的生化代謝的任何步驟受到干擾,都可能導(dǎo)致靶昆蟲的死亡或生長發(fā)育異常。目前,已有20多種昆蟲的EcR和(或)USP被克隆,其中EcR具有種類和種群的特異性,而EcRE的結(jié)構(gòu)則以黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)的小分子熱休克蛋白基因啟動子(Hsp27-promoter)最為典型。目前第一、二代殺蟲劑環(huán)境危害性弊端突顯,而昆蟲抗藥性則是第三代殺蟲劑面臨的主要問題,開發(fā)多種殺蟲劑循環(huán),聯(lián)合使用則是減少害蟲抗藥性產(chǎn)生的首要途徑,所以建立能夠高效篩選新型殺蟲劑的高通量篩選模型迫在眉睫,Hien TT等在酵母中建立了一個針對云杉色卷蛾(Choristoneura fumiferana,Cf)EcR的配體調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄激活(transactivation)系統(tǒng),應(yīng)用果蠅Hsp27啟動子序列上的響應(yīng)元件EcRE(23bp),連接上CYC1(iso-1-cytochrome C)啟動子,在CfEcR及CfUSP同時存在時,在沒有配體存在的情況下,EcR與USP也可自發(fā)形成二聚體使報告基因強(qiáng)烈表達(dá)。因而我們可以在酵母體內(nèi)組成型表達(dá)衛(wèi)生害蟲的EcR及USP,用EcR/USP二聚體啟動果蠅EcRE-Hsp27啟動子,使得昆蟲蛻皮調(diào)節(jié)通路關(guān)鍵調(diào)節(jié)階段在酵母中重現(xiàn),并且在啟動子后連接綠色熒光蛋GFP報告基因,利用這個模型來篩選作用于調(diào)節(jié)通路的藥物,進(jìn)而開發(fā)出活性高、專一性強(qiáng)、對人畜安全、在生物體內(nèi)易降解的新型生物殺蟲劑。 目的:建立衛(wèi)生害蟲蛻皮激素類似物殺蟲劑篩選模型,通過此構(gòu)建的酵母模型篩選昆蟲蛻皮激素受體結(jié)合調(diào)節(jié)劑,然后利用篩出的藥物作用于衛(wèi)生害蟲,進(jìn)而開發(fā)出活性高、專一性強(qiáng)、對人畜安全、在生物體內(nèi)易降解的新型生物殺蟲劑。 方法:人工合成白紋伊蚊(Aedes albopictus)EcR和USP的編碼序列,兩個基因以雙表達(dá)盒形式亞克隆入表達(dá)質(zhì)粒pGAP-Z,并整合到畢赤酵母(Pichia pastoris)的染色體上使EcR與USP在酵母中組成型表達(dá),構(gòu)建成酵母A。人工合成果蠅EcRE,從果蠅基因組DNA中擴(kuò)出Hsp27-promoter序列,再接上綠色熒光蛋白(Green fluorescence protein,GFP)報告基因,將EcRE-Hsp27promoter-GFP片段亞克隆入pPIC3.5k,并整合到畢赤酵母A染色體的另一位點(diǎn)上(pGAP-Z與pPIC3.5k與畢赤酵母染色體的整合位點(diǎn)不同),從而構(gòu)建成酵母模型(酵母B),通過施加蛻皮激素類似物二芳酰肼類農(nóng)藥蟲酰肼驗(yàn)證酵母模型的敏感性,并初步使用酵母模型篩選一部分放線菌分泌物。 結(jié)果:成功的構(gòu)建了酵母表達(dá)質(zhì)粒pGAP-Z-TEF-USP-CYC-EcR、pPIC3.5K-ECRE-Hsp-GFP,轉(zhuǎn)化后的酵母模型在熒光顯微鏡下可見綠色熒光,證明EcR、USP在酵母中成功表達(dá),兩者結(jié)合形成的EcR/USP二聚體作用于EcRE啟動報告基因表達(dá)熒光蛋白。施加藥物蟲酰肼后模型酵母熒光強(qiáng)亮度遠(yuǎn)低于未加藥物的對照組模型酵母,表明GFP的表達(dá)受到抑制。半定量RT-PCR證實(shí)在蟲酰肼作用下酵母模型內(nèi)GFP基因的轉(zhuǎn)錄水平低于對照組。利用酵母模型篩選放線菌分泌物,發(fā)現(xiàn)一株放線菌分泌物可以影響酵母生長。 結(jié)論:首次構(gòu)建了以GFP為報告基因的衛(wèi)生害蟲蛻皮激素類似物殺蟲劑酵母篩選模型。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R184

【引證文獻(xiàn)】

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1 焦?jié)M靜;中華絨螯蟹蛻皮機(jī)制與影響因素的研究[D];河北大學(xué);2013年

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本文編號：2471154