【摘要】： 目的人體蠕形螨(human Demodex)寄生于人毛囊、皮脂腺內(nèi),可引起痤瘡、毛囊炎、酒渣鼻、瞼緣炎、脫發(fā)等癥。山羊蠕形螨(Demodex caprae)能引起羊皮皮脂腺囊腫,致使板皮穿孔,給畜牧業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。目前有關(guān)蠕形螨的流行病學(xué)及治療藥物的研究較多,而其超微結(jié)構(gòu)、組織化學(xué)、致病機(jī)理及分子生物學(xué)方面的研究因技術(shù)瓶頸的限制進(jìn)展困難。本實驗在探索活蠕標(biāo)本顯微處理技術(shù)的基礎(chǔ)上,建立蠕形螨整體染色法,應(yīng)用組織化學(xué)技術(shù)、酶組織化學(xué)技術(shù)觀察兩種人體蠕形螨和山羊蠕形螨的形態(tài)、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、化學(xué)成分、酶及其在體內(nèi)的分布。應(yīng)用酶學(xué)方法測定山羊蠕形螨體內(nèi)酯酶及蛋白酶的活性。經(jīng)方法改良,提取山羊蠕形螨基因組DNA。目的是為今后從染色法、酶學(xué)、分子生物學(xué)角度研究蠕形螨的結(jié)構(gòu)、生理、分類和致病機(jī)理鋪平道路。 方法用自制刮片加壓刮取人額部皮脂;切開新鮮山羊皮下結(jié)節(jié)取出其中干酪樣物;將標(biāo)本充分浸沒于洗滌劑中,在解剖鏡直視下,用自制挑螨針將螨從皮脂中分離并反復(fù)清洗干凈。將潔凈活蠕分類置于超純水中,于-20℃冷凍48小時后,采用自創(chuàng)的蠕形螨整體染色技術(shù)染色:用Giemsa染料染色顯示內(nèi)部結(jié)構(gòu),碘液染色顯示糖原,油溶紅O染色顯示脂類,甲基綠染色顯示DNA。采用Gomori法對酸性磷酸酶、堿性磷酸酶進(jìn)行染色,采用Gomori醋酸-α-萘酯法對酯酶進(jìn)行染色,采用Tween法對脂肪酶進(jìn)行染色。在解剖顯微鏡直視下,將潔凈新鮮的山羊蠕形螨置于自制冰冷微型研缽中研磨粉碎,冷凍離心,取上清液為酶源。參照Asperene的方法,以醋酸-α-萘酯為底物,固藍(lán)B鹽為顯色劑,在600nm波長下測吸光度來測定山羊蠕形螨酯酶活性;制作1‰明膠、1%瓊脂平板,打孔,在孔中滴加50μl酶源,30℃作用4小時后考馬斯亮藍(lán)R250染色檢測山羊蠕形螨蛋白酶活性。用改進(jìn)法提取山羊蠕形螨的基因組DNA,以瓊脂糖電泳及紫外分光光度計進(jìn)行檢測。 結(jié)果經(jīng)過組織化學(xué)染色后,三種蠕形螨內(nèi)部結(jié)構(gòu)、糖原、酯類及DNA著色。經(jīng)過酶組織化學(xué)染色,三種蠕形螨體內(nèi)酸性磷酸酶、脂肪酶所在部位被染成棕黑色,堿性磷酸酶所在部位被染成黑色,酯酶所在部位被染成紫紅色。Asperene法測酯酶活性,酶源組吸光度為0.205±0.027,陰性對照組吸光度為0.090±0.008,兩組間有顯著差異(P＜0.01)。以明膠平板法測定山羊蠕形螨蛋白酶活性,考馬斯亮藍(lán)R250染色后酶源所在孔周圍形成透明環(huán),說明酶源中含有能消化明膠的蛋白酶。用改進(jìn)的方法,成功用5000條山羊蠕形螨提取出基因組DNA,瓊脂糖電泳顯示為一高分子量DNA條帶,紫外分光光度計檢測OD_(260)/OD_(280)大于1.6。 結(jié)論自創(chuàng)的蠕形螨整體染色法解決了蠕形螨整體染色顯示內(nèi)部結(jié)構(gòu)的問題。發(fā)現(xiàn)三種蠕形螨體內(nèi)含有大量的糖原、酯類和DNA,具有酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、酯酶和脂肪酶活性。山羊蠕形螨體內(nèi)酯酶及蛋白酶活性較高。這支持蠕形螨以脂類和角蛋白為食的觀點,它可能是一種脂螨。同時酶可能是蠕形螨致病的化學(xué)物質(zhì)。成功提取出高質(zhì)量的山羊蠕形螨基因組DNA。以上創(chuàng)新性工作為今后從染色法、酶學(xué)、分子生物學(xué)角度研究蠕形螨的結(jié)構(gòu)、生理、分類和致病機(jī)理鋪平道路。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R184;S852.7

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 劉艷榮;人體毛囊蠕形螨、皮脂蠕形螨和山羊蠕形螨的ISSR-PCR與遺傳分析[D];山東大學(xué);2012年

2 肖克源;蠕形螨cDNA文庫的構(gòu)建及初步分析[D];山東大學(xué);2013年

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本文編號：2287124