本文選題：肝炎病毒戊型 + 基因型　； 參考：《華中科技大學(xué)》2006年博士論文

【摘要】： 戊型肝炎病毒(HEV)是通過糞-口途徑傳播的非甲非乙型肝炎的一個主要病因，在亞洲、非洲和拉丁美洲的一些發(fā)展中國家呈流行或散發(fā)流行，近期研究發(fā)現(xiàn)戊型肝炎散發(fā)發(fā)病率呈上升趨勢。目前在中國戊型肝炎的發(fā)病率大約為10％-20％，其中大部分病例為青少年和成人，也有小部分為兒童和老人。盡管戊型肝炎引起的總體死亡率很低，但孕婦感染HEV后其死亡率可達20％。武漢地區(qū)，近年來戊型肝炎散發(fā)發(fā)病呈上升趨勢，而目前臨床上主要通過檢測抗HEV-IgM和抗HEV-IgG來作為診斷指標(biāo)。許多HEV抗原，包括合成肽、ORF3重組蛋白和大多數(shù)ORF2重組蛋白，對急性期血清有較好的活性，但對恢復(fù)期血清的反應(yīng)性則較弱或結(jié)果不易判斷。若用于血清流行病學(xué)研究會明顯低估感染率，在臨床診斷中無法判斷既往感染與近期感染。雖然用于檢測的抗原片斷不斷更新，檢測方法多種多樣，目前市場提供的抗HEV-IgM檢測試劑盒仍由于靈敏度太低而無法滿足臨床診斷需要。因此，可靠的抗戊型肝炎病毒IgM以及IgG診斷試劑的研制，建立新的診斷方法是一個急待解決的問題。 來自世界不同地區(qū)的戊型肝炎病毒核苷酸序列不完全相同，根據(jù)戊型肝炎病毒核苷酸序列的同源性75％以上定義為同一個基因型，可將全球分離的HEV分為8個基因型，至少24個基因亞型。同一個體感染的戊型肝炎病毒核苷酸序列也不完全相同，其差異大約在2-15％，不超出病毒不同的基因型或亞型，稱為準(zhǔn)種。戊型肝炎病毒的異質(zhì)性和臨床特征對于理解其致病特點、建立特異性的珍斷試劑盒以及制備相應(yīng)的疫苗具有重要意義。 HEV基因序列有3個部分重疊的開放讀碼框(ORF)，ORF1主要編碼與病毒RNA復(fù)制有關(guān)的非結(jié)構(gòu)蛋白，ORF2為HEV的主要的結(jié)構(gòu)基因編碼區(qū)，編碼衣殼蛋白，ORF3僅有369個核苷酸，與ORF1有1nt重疊，與ORF2有328nt重疊，產(chǎn)物含123個氨基酸，分子量為13.5kD。編碼的產(chǎn)物與HEV的特異性免疫反應(yīng)、病毒組裝有關(guān)，參與調(diào)節(jié)MAPK細胞信號傳導(dǎo)過程，與腫瘤激活基因101相互作用，ORF3的功能特點類似慢性肝炎的過程，其功能亦不明了。 為此，本課題對在武漢同濟醫(yī)院住院及門診就診的戊型肝炎病人進行了流行病學(xué)調(diào)查及基因分型，建立了用免疫吸附測定法(ELISA)檢測病人血清中的抗-HEV IgA的方法，顯示其在戊型肝炎診斷中的必要性。同時我們成功地構(gòu)建了重組pEGFP-ORF3和pXF2RH-ORF3融合蛋白的真核表達載體，并且在HepG2細胞系上獲得了穩(wěn)定表達，最后我們探討了他們對HepG2細胞系增殖和凋亡的影響，為進一步研究ORF3功能奠定了基礎(chǔ)。 目的 1．研究武漢地區(qū)戊型肝炎病毒(HEV)流行病學(xué)特點及基因分型，了解我國戊型肝炎病毒異質(zhì)性分布特點，尋求基因型別與疾病臨床轉(zhuǎn)歸的關(guān)系。 2．建立酶聯(lián)免疫吸附檢測血清抗HEV-IgA的方法，試圖提高HEV診斷的敏感性、特異性。 3．研究HEV開放讀碼框架3(ORF3)基因序列的準(zhǔn)種特點，從基因水平尋找ORF3功能的基礎(chǔ)。 4．構(gòu)建表達戊型肝炎病毒(HEV)pEGFP-ORF3和pXF2RH-ORF3融合蛋白的真核表達載體；獲得重組質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HepG2細胞系，為HEV ORF3功能的研究作前期準(zhǔn)備。 5．初步研究pEGFP-ORF3和pXF2RH-ORF3融合蛋白對HepG2細胞的增殖和凋亡作用。 方法 1．收集從2003年8月-2004年8月同濟醫(yī)院就診的急性戊型肝炎患者916例，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄-套式聚合酶鏈反應(yīng)法(RT-nested-PCR)，擴增HEV開放讀碼框架2(ORF2)的部分序列120份，選取其中25份進行測序，結(jié)果用Clustal X和Treeview軟件比較武漢地區(qū)HEV序列與4個HEV主要代表株序列。 2．應(yīng)用北京萬泰公司商品化基因重組HEV ORF-2／ORF-3抗原預(yù)包被的酶標(biāo)板，HRP標(biāo)記羊抗人IgA建立檢測血清抗HEV-IgA的方法。酶聯(lián)免疫試驗檢測60例HEV RNA陽性戊型肝炎患者不同時間段血清抗HEV-IgA、抗HEV-IgM(捕獲法)、抗HEV-IgG水平。 3．在經(jīng)測序證實HEV血樣本中，挑選2份標(biāo)本，擴增其中HEV開放讀碼框架3(ORF3)的全部序列，克隆入pMD18-T Vector，其中1例挑選30個克隆進行測序。 4．利用PCR技術(shù)從HEV基因組中擴增出ORF3基因片斷，EcolⅠ／BamHⅠ雙酶切后分別連接到經(jīng)同樣酶切的pEGFP-N2和pXF2RH真核表達載體，轉(zhuǎn)化DH5α菌株感受態(tài)細胞，獲得陽性重組質(zhì)粒pEGFP-ORF3和pXF2RH-ORF3。將陽性克隆用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染HepG2細胞，G418篩選抗性克隆，在熒光顯微鏡下觀察pEGFP-ORF3增強型綠熒光蛋白表達，SDS-PAGE、Western blot分析鑒定pXF2RH-ORF3融合蛋白的表達。 5．用MTT比色法測定細胞增殖情況，流式細胞儀碘化丙啶染色法檢測細胞周期和細胞凋亡情況。 結(jié)果 1．25例散發(fā)性戊型肝炎病毒，核苷酸同源性在82.61-98.55％，與Ⅰ型(緬甸株)、Ⅱ型(墨西哥株)、Ⅲ型(美國株)、Ⅳ型(中國／臺灣株)核苷酸同源性分別為76.52-81.74％、70.43-73.04％、76.52-81.16％和84.35-88.70％。系統(tǒng)進化樹顯示它們至少可分為三個亞型。 2．60例戊型肝炎患者血清抗HEV-IgA、抗HEV-IgM全部陽性。410例非戊型肝炎病人中，6例抗HEV-IgA陽性，7例抗HEV-IgM，除1例抗HEV-IgA、抗HEV-IgM同時陽性外(隱性感染)，其余均為單陽性，抗HEV-IgG和HEV RNA陰性。動態(tài)檢測戊型肝炎患者血清HEV RNA、抗HEV-IgA、抗HEV-IgM和抗HEV-IgG，發(fā)現(xiàn)急性戊型肝炎血清HEV RNA持續(xù)陽性至病后2月(20±11d)，抗HEV-IgA、抗HEV-IgM陽性持續(xù)整個觀察期，半數(shù)陽性率分別持續(xù)3個月和4個月，從病后第2個月起，，抗HEV-IgA、抗HEV-IgM陽性率在同月相比，差異有顯著意義。 3．2例ORF3區(qū)全基因組堿基序列同源性為90.43％～93.62％，來源于同一患者ORF3區(qū)全基因組不同克隆之間的堿基序列同源性為97.97％～99.71％，與Ⅳ型(中國／臺灣株)核苷酸同源性為89.86％～99.71％。ORF3區(qū)可檢出點突變、缺失突變、短序列的插入突變。 4．真核表達載體轉(zhuǎn)染HepG2細胞，經(jīng)持續(xù)G418壓力篩選和有限稀釋法克隆化獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞系，細胞內(nèi)表達增強型綠熒光蛋白，SDS-PAGE在28.5kD左右蛋白表達量明顯高于對照組，Western blot在28.5kD左右有一條強的棕色條帶，說明pEGFP-ORF3和pXF2RH-ORF3在HepG2細胞中得到表達。 5．pEGFP-ORF3和pXF2RH-ORF3轉(zhuǎn)染組的HepG2細胞的增殖速度比未轉(zhuǎn)染組和空載體轉(zhuǎn)染組細胞輕度升高，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。轉(zhuǎn)染的腫瘤細胞株HepG2的細胞周期分布是G1=68.09％和67.1％，S=19.50％和19.0％，G2=12.41％和13.9％，凋亡率為0.83％和0.86％；未轉(zhuǎn)染HepG2細胞周期分布是G1=72.15％，S=14.91％，G2=12.95％，凋亡率為1.41％，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。流式細胞儀檢測細胞凋亡峰不明顯。 結(jié)論 1．武漢地區(qū)散發(fā)性戊型肝炎患者以HEVⅣ型感染為主。散發(fā)性戊型肝炎發(fā)病率呈上升趨勢，發(fā)病年齡以30歲至59歲為主，男∶女之比約為3.3∶1，全年均可發(fā)病，3-6月為高峰季節(jié)。 2．成功建立檢測血清抗HEV-IgA的方法，戊型肝炎患者抗HEV-IgA陽性率較抗HEV-IgM陽性率特異性強、持續(xù)時間長。聯(lián)合HEV-IgM和抗HEV-IgA檢測，可提高急性戊型肝炎診斷的敏感性。 3．多個克隆測序結(jié)果提示患者體內(nèi)HEV呈現(xiàn)準(zhǔn)種群共存，HEV-ORF3 C末端2個富含脯氨酸區(qū)多有點突變，點突變不影響脯氨酸表達。 4．在HepG2細胞中高表達pEGFP-ORF3和pXF2RH-ORF3融合蛋白，可獲得大量融合蛋白。 5．轉(zhuǎn)染pEGFP-ORF3和pXF2RH-ORF3融合蛋白的真核表達載體對HepG2細胞增殖速度與細胞凋亡無明顯影響。 本研究的創(chuàng)新點 1．首次研究武漢地區(qū)戊型肝炎病毒(HEV)流行病學(xué)特點、基因分型和HEV開放讀碼框架3(ORF3)基因序列的準(zhǔn)種特點。 2．初步建立了酶聯(lián)免疫吸附檢測血清抗HEV-IgA的方法。 3．首次在HepG2細胞表達HEV開放讀碼框架3(ORF3)基因編碼融合蛋白，該蛋白沒有引起HepG2細胞明顯的凋亡，是否對細胞有增殖作用有待進一步研究。 研究意義 1．HEV病毒基因分型的研究可以加強對病毒起源及進化的認(rèn)識；有助于分析戊型肝炎在全球范圍內(nèi)的地理分布特征，更好地了解HEV變異性和流行病學(xué)特征；了解其基因異質(zhì)性與抗原異質(zhì)性之間的關(guān)系，可以考慮建立不同基因型HEV感染的檢測方法，提高檢測特異性，進而避免因抗體特異性減弱或降低而導(dǎo)致的誤診�？傊畬Σ《镜呐R床治療和預(yù)防都有著重要的意義。 2．戊型肝炎病毒(HEV)感染的診斷主要依賴于可靠的檢測方法，目前臨床常檢測抗-HEV IgG及IgM�？�-HEV IgG出現(xiàn)早，檢出率高，但持續(xù)時間長，發(fā)病后6～12個月大部分患者抗-HEV IgG仍然陽性，因此無法區(qū)分是急性戊型肝炎還是既往HEV感染�？�-HEV IgM出現(xiàn)早，發(fā)病三個月以后基本轉(zhuǎn)陰，是急性戊型肝炎的特異指標(biāo)，但檢測的靈敏度不高(60％～70％)。因而在戊型肝炎診斷中有一定的局限性，抗HEV-IgA可作為戊型肝炎近期感染的輔助抗體，同時檢測抗-HEV IgA，可提高診斷率和檢測敏感性，還協(xié)助假陽性的判斷，有利于正確診斷。 3．戊型肝炎病毒感染，臨床癥狀顯著者多是15-30歲年輕人，死亡率0.5-3.0％，孕婦死亡率高達20％。其發(fā)病機制可能有病毒直接損傷肝細胞和免疫損傷參與，詳細機制不明。ORF3是胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)和應(yīng)激活化蛋白激酶／C-Jun N端激酶等MAPK超家族激酶的底物，可能參與細胞的生長、凋亡過程。ORF3功能的研究有利于進一步了解HEV致病機制及確定治療方案。
[Abstract]:Hepatitis E virus ( HEV ) is a major cause of non - A non - hepatitis B transmitted through the feces - oral route . In some developing countries in Asia , Africa and Latin America , the incidence of hepatitis E is increasing .









The hepatitis E virus nucleotide sequence from different regions of the world is not identical , and is defined as the same genotype according to the homology of 75 percent of the hepatitis E virus nucleotide sequence , and the HEV can be divided into 8 genotypes and at least 24 gene subtypes according to the homology of the hepatitis E virus nucleotide sequence .









There are three partially overlapping open reading frames ( ORFs ) in the gene sequence of HEV . ORF1 mainly encodes the non - structural protein related to viral RNA replication , the main structural gene coding region of HEV , the capsid protein , ORF3 only 369 nucleotides , the product contains 123 amino acids , the molecular weight is 13.5kD . The encoded product is related to the specific immune response and viral assembly of HEV . The function of ORF3 is similar to that of chronic hepatitis . The function of ORF3 is unknown .









In this paper , the epidemiological investigation and genotyping of hepatitis E patients in hospitalized and outpatient clinics in Tongji Hospital of Wuhan were carried out . The necessity of ELISA for detecting anti - HEV IgA in sera of patients with hepatitis E was established .









Purpose









1 . To study the epidemiological characteristics and genotyping of hepatitis E virus ( HEV ) in Wuhan , and to find out the characteristics of the heterogeneity of hepatitis E virus in China , and to seek the relationship between genotype and clinical outcome of disease .









2 . Establish enzyme - linked immunosorbent assay ( ELISA ) to detect anti - HEV - IgA in serum , and try to improve the sensitivity and specificity of HEV diagnosis .









3 . To study the characteristics of ORF3 gene sequence in HEV open reading frame 3 ( ORF3 ) , and find out the basis of ORF3 function from gene level .









4 . constructing a eukaryotic expression vector expressing the fusion protein of the recombinant hepatitis E virus ( HEV ) and the pXF2RH - ORF3 fusion protein ;
The HepG2 cell line stably transfected with the recombinant plasmid was obtained and prepared for the study of the function of the HEV ORF3 .









5 . The proliferation and apoptosis of HepG2 cells were studied by using the fusion protein of pXF2RH - ORF3 fusion protein .









method









1 . 916 cases of acute hepatitis E from August 2003 to August 2004 were collected . Reverse transcription - nested polymerase chain reaction ( RT - nested - PCR ) was used to amplify 120 parts of the sequence of HEV open reading frame 2 ( ORF 2 ) . Twenty - five of them were sequenced . The results showed that the sequences of HEV in Wuhan were compared with four HEV sequences .









2 . ELISA was used to detect anti - HEV - IgA in sera of 60 HEV RNA - positive patients with HEV RNA positive HEV - IgA , anti - HEV - IgM ( capture method ) and anti - HEV - IgG level in 60 HEV RNA - positive patients with HEV RNA positive HEV .









3 . In the blood samples confirmed by sequencing , two specimens were selected to amplify the entire sequence of the HEV open reading frame 3 ( ORF3 ) , and cloned into pMD18 - T Vector , among which one selected 30 clones for sequencing .









4 . The ORF3 gene fragment was amplified from the genome of HEV by PCR . Ecol 鈪

本文編號：1833925